柏國清，李思鋒，李為民，李忠虎，楊 娟，趙桂仿＊

（1陜西省西安植物園／陜西省植物研究所，西安710061；2西北大學生命科學學院西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，西安710069；3西安交通大學環(huán)境與疾病相關基因教育部重點實驗室生物醫(yī)學研究實驗中心／醫(yī)學院遺傳學與分子生物學系，西安710061）

中國特有金錢槭屬植物物種分化研究

柏國清1，2，李思鋒1，李為民1，李忠虎2，楊 娟3，趙桂仿2＊

（1陜西省西安植物園／陜西省植物研究所，西安710061；2西北大學生命科學學院西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，西安710069；3西安交通大學環(huán)境與疾病相關基因教育部重點實驗室生物醫(yī)學研究實驗中心／醫(yī)學院遺傳學與分子生物學系，西安710061）

金錢槭屬（Dipteronia Oliv.）隸屬于槭樹科（Aceraceae），是北溫帶植物區(qū)系中古老、殘遺的木本屬之一，為中國特有屬，屬下僅包括金錢槭（D.sinensis Oliv.）和云南金錢槭（D.dyerana Henry）2個物種。本實驗從形態(tài)學、分子遺傳學及基因序列分析等方面對金錢槭（D.sinensis Oliv.）和云南金錢槭（D.dyerana Henry）進行對比研究，探討其物種間分化程度。結果表明：（1）形態(tài)學研究顯示兩物種形態(tài)性狀存在顯著差異，表明其在形態(tài)上發(fā)生了顯著分化；（2）基因組DNA的AFLP標記分析表明，兩物種間存在極顯著遺傳分化（ΦST＝0.390 4），在物種水平及群體水平，兩物種遺傳多樣性及遺傳變異水平皆有明顯差異（金錢槭＞云南金錢槭）；（3）從GenBank數(shù)據(jù)庫中選出2物種已知的葉綠體基因（psbM－trnD、trnD－trnT、trnL、trnL－trnF、rpl16）和核基因ITS（ITS1、5.8SRNA、ITS2）進行序列進化比對分析，t－test檢驗表明，2物種葉綠體基因序列間有極顯著差異。研究結果表明：金錢槭和云南金錢槭兩物種間產(chǎn)生了極顯著的分化，推測可能由于長期的地理隔離所致。

金錢槭；云南金錢槭；形態(tài)學；分子遺傳學；種間分化

金錢槭屬（Dipteronia Oliv.）隸屬于槭樹科（Aceraceae），是北溫帶植物區(qū)系中古老、殘遺的木本屬之一，為中國特有屬［1］。該屬植物為落葉喬木，花期4～6月，果期8～10月，染色體2n＝18，屬于少種屬。屬下僅包括云南金錢槭（D.dyerana Henry）和金錢槭（D.sinensis Oliv.）2個物種，分別被列為國家二級、三級珍稀瀕危保護植物。兩物種形態(tài)特征存在顯著差異，二者不同之處在于金錢槭為圓錐狀花序無毛，而云南金錢槭圓錐狀花序有密的黃綠色短絨毛；金錢槭果實小于云南金錢槭。兩物種在自然地理分布區(qū)上也存在著明顯不同，無重疊分布區(qū)。金錢槭分布于中國陜西、甘肅、河南、湖北、湖南、貴州、四川及重慶等地。而云南金錢槭僅零星分布于中國云南省文山縣、蒙自縣、屏邊縣等地區(qū)［2］。長期以來，關于金錢槭屬植物的研究多集中在該屬的形態(tài)發(fā)育和系統(tǒng)分類方面［3－6］。鑒于金錢槭屬內(nèi)兩物種生物學性狀存在明顯差異，本研究擬對金錢槭和云南金錢槭進行形態(tài)學比較研究，檢測兩物種的形態(tài)分化程度。

AFLP（amplified fragment length polymorphism）標記是一種用于群體分子生態(tài)、群體遺傳研究的有效方法［7］。近年來在種群生態(tài)、品系鑒定、基因定位、遺傳多樣性研究等方面表現(xiàn)出廣泛的應用價值。AFLP是顯性標記，該技術不但具備其他DNA分子標記如：RAPD、RFLP、SSR等所具有的優(yōu)點，而且還具有用量少、靈敏度高、擴增條帶豐富、可重復性高、快速高效等特點，一次分析可獲得基因組大量的遺傳信息，并可檢測出大量的多態(tài)性條帶，特別是對具親緣關系及遺傳上區(qū)別不大的種類來說是較合適的分子標記方法［8－9］。本研究將結合形態(tài)學、基于基因組DNA的AFLP標記對金錢槭屬內(nèi)兩物種進行比較研究，分析兩物種的形態(tài)分化程度，檢測兩物種的遺傳多樣性水平，揭示其種間分化程度，探討種間親緣關系。另外結合GenBank中兩物種已知的幾個葉綠體基因及核基因的序列比對結果，從分子水平進一步揭示兩物種間的分化水平，為金錢槭屬及槭樹科植物的進化生物學研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 研究材料

本研究所用的植物材料分別采自金錢槭自然地理分布區(qū)陜西、河南、甘肅、四川、重慶、湖北、湖南、貴州等8個省區(qū)的13個居群，云南金錢槭采自云南境內(nèi)4個居群（表1）。為保證取樣的可靠性，對各個居群中的每個被調查個體，從東、南、西、北4個方向選最基部分枝和近基部第3個分枝，從分支中部選取2對羽狀復葉，將復葉上近基部的6片小葉摘下浸于FAA固定液中；并從東、西、南、北4個方向，分上下2層在果序上選取成熟翅果，并壓制成標本；同時采集金錢槭、云南金錢槭各個居群新鮮幼嫩的植物葉片，迅速裝入密封袋用硅膠迅速干燥，帶回實驗室置于超低溫冰箱（－80℃）保存，用于分子遺傳學實驗。

1.2 研究方法

1.2.1 形態(tài)學研究 參照李珊［10］的方法，形態(tài)學性狀研究共測量17項宏觀、微觀形態(tài)性狀。每個居群取3個個體的平均值作為該居群的各項指標數(shù)值。用SPSS 11.0軟件包計算同種內(nèi)不同居群各項形態(tài)指標的平均值±標準誤差，用OriginPro 7.5軟件對2種植物各項形態(tài)學指標數(shù)值分別進行單因素方差分析，在0.01及0.05水平下對2物種總樣本的各項數(shù)值進行顯著性t檢驗。

1.2.2 群體遺傳學研究 采用植物基因組DNA的AFLP分子標記對金錢槭和云南金錢槭進行遺傳多樣性、遺傳結構和種間分化研究。采用改良的CTAB法提取金錢槭屬植物基因組DNA［11－12］。

AFLP反應按照酶切連接一步法、預擴增－選擇性擴增兩步法進行［12］。選擇性擴增從32對PstⅠ＋3／MseⅠ＋3引物組合中篩選出多態(tài)位點檢出率高、擴增結果穩(wěn)定的8對引物組合（P－GAA／MCAA、P－GAA／M－CAC、P－GAA／M－CAG、P－GAG／MCAA、P－GAG／M－CAA、P－GAG／M－CAC、P－GAG／MCTG、P－GAG／M－CTT），對金錢槭和云南金錢槭進行比較研究。

擴增結果按照條帶的有無（顯性、隱性）記為0、1數(shù)據(jù)，形成AFLP原始數(shù)據(jù)矩陣。應用POPGENE（ver.1.31）［13］計算種水平、群體水平的多態(tài)位點百分率（PPB）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、Nei基因多樣性指數(shù)（H）以及種內(nèi)居群間遺傳分化系數(shù)（Gst）。檢測種內(nèi)群體間基因多樣度（Ht）以及群體內(nèi)基因多樣度（Hs）。AMOVA（Analysis of Molecular Variation）用來分析種間遺傳分化系數(shù)（ΦST）以及種內(nèi)居群間、居群內(nèi)遺傳變異成分（Vc）。

1.2.3 序列比對分析 從GenBank搜索金錢槭和云南金錢槭葉綠體基因（psbM－trnD、trnD－trnT、trnL、rpl16、trnL－trnF）以及核基因ITS（ITS1、5.8SRNA、ITS2），采用BioEdit v5.0.6［14］軟件中ClustalW進行序列比對分析，計算插入缺失、成對序列的相似性等。采用MEGA v5.0［15］分析成對序列的堿基組成、相同位點、轉換、顛換、轉換與顛換比值、同一基因及間隔區(qū)序列間的遺傳距離。采用SPSS 11.0軟件對兩物種已知葉綠體基因序列進行顯著性檢驗。

表1 2個物種的居群信息Table 1 Population resource of two species

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學分析

對金錢槭和云南金錢槭植物的17項形態(tài)指標（表2）分析比較發(fā)現(xiàn)，云南金錢槭小葉長、小葉寬、小葉脈數(shù)及復葉葉柄長高于金錢槭，且有顯著差異。云南金錢槭果實長、果實寬、果實厚及果實重量高于金錢槭，且有顯著差異。云南金錢槭種子長、種子寬、種子厚及種子重顯著高于金錢槭。通過結果分析發(fā)現(xiàn)，兩物種形態(tài)水平存在顯著差異，較明顯的差異是果實的大小、種子的重量及小葉形態(tài)。

2.2 遺傳多樣性

通過篩選出的8對引物組合對金錢槭和云南金錢槭進行選擇性擴增，共得到324個擴增片段，由表2可以看出，金錢槭種內(nèi)多態(tài)性片段（PPB）為86.73%，云南金錢槭為78.09%；Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）在金錢槭和云南金錢槭物種水平分別為0.332 1和0.304 7；Shannon多樣性指數(shù)（I）在2物種水平分別為0.487 4和0.445 0。在群體水平，3個指數(shù)（PPB，H，I；表3）在金錢槭種群內(nèi)平均值為57.29%、0.234 3、0.339 5，在云南金錢槭種群內(nèi)為52.16%、0.204 4、0.299 1。AMOVA分析表明在金錢槭種內(nèi)有21.53%變異發(fā)生在群體間，78.47%變異存在于群體內(nèi)；云南金錢槭種內(nèi)有26.49%變異發(fā)生在群體間，73.51%變異存在于群體內(nèi)。

表2 2個物種的形態(tài)比較Table 2 Morphological comparation of two species

表3 2個物種間遺傳參數(shù)的比較Table 3 A comparison of genetic parameters between two species

2.3 遺傳分化

本研究對金錢槭、云南金錢槭兩物種的基因多樣性（Nei’s）進行分析，結果（表3）表明：金錢槭的基因多樣度為0.333 1（Ht）和0.234 2（Hs），云南金錢槭為0.303 5（Ht）和0.204 4（Hs）；兩物種居群間遺傳分化指數(shù)（Gst）分別為0.297 0和0.326 6；基因流（Nm）分別為1.183 8和1.031 0，AMOVA分析表明金錢槭與云南金錢槭兩種間存在極顯著的遺傳分化（ΦST＝0.390 4，P＜0.001）。

金錢槭和云南金錢槭葉綠體基因（psbM－trnD、trnD－trnT、trnL、rpl16、trnL－trnF）和核基因ITS（ITS1，5.8SRNA，ITS2）序列比對結果（表4）表明，2物種葉綠體基因和核基因序列間發(fā)生了較大的堿基替換。其中，轉換與顛換比值在葉綠體基因序列間為0.8～1.4，在核基因ITS序列為3.1。葉綠體基因序列的顯著性檢驗結果表明，2物種已知葉綠體基因序列間存在極顯著差異（P＝0.006 8＜0.01）。

表4 基因庫中金錢槭和云南金錢槭的序列分析Table 4 The alanalysis of sequence pairs of species D.sinensis and D.dyeranafrom GenBank

3 討 論

關于物種不同的研究方向其定義不同。在分類學上，物種是依據(jù)表型特征識別和區(qū)分生物的基本單位。在現(xiàn)代遺傳學上，物種是一個具有共同基因庫，與其他類群有生殖隔離的群體。在生態(tài)學上，物種是生態(tài)系統(tǒng)中的功能單位，不同物種占有不同的生態(tài)位，如果2個物種以相似的方式利用同一有限的資源和能源，他們必定會發(fā)生競爭和相互排斥；必定有一個獲得相對的勝利，如果一個物種的種內(nèi)發(fā)生了變異，占據(jù)了多個生態(tài)位，從生態(tài)學角度看，就意味著新種的生成。對于金錢槭屬，經(jīng)典分類學根據(jù)其屬內(nèi)植物的表型特點，將其分為金錢槭和云南金錢槭，本研究采用了17個常用形態(tài)指標對兩物種進行對比研究發(fā)現(xiàn)，金錢槭和云南金錢槭在形態(tài)上已產(chǎn)生顯著的分化。最顯著的形態(tài)差異是果實及種子的大小和重量，云南金錢槭遠大于金錢槭平均水平；其次是小葉形態(tài)，云南金錢槭也明顯較金錢槭大。在生態(tài)學上，金錢槭和云南金錢槭作為2個獨立的物種，具有各自的生態(tài)位，無重疊的分布區(qū)。分子遺傳學研究表明：金錢槭屬內(nèi)兩種間存在極顯著的分化（ΦST＝0.390 4；P＜0.001），且兩物種的遺傳多樣性和居群遺傳結構存在明顯的差異。金錢槭種內(nèi)、群體平均水平遺傳多樣性及遺傳變異皆高于云南金錢槭，這與廣布種的遺傳多樣性高于狹域種相符。物種的遺傳多樣性大小是長期進化的產(chǎn)物，是其生存（適應）和發(fā)展（進化）的前題［16］。物種的遺傳多樣性越高、遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應能力越強，越容易擴散其分布范圍和開拓新的環(huán)境［17］。理論推導和大量實驗證據(jù)表明，生物居群中遺傳變異的大小與其進化速率成正比［18］。因此，對遺傳多樣性的研究可以揭示物種的進化歷史。

而本研究中金錢槭種內(nèi)、居群內(nèi)遺傳多樣性均高于云南金錢槭，推測可能的原因有以下幾方面：首先，田欣等［4］通過廣義形態(tài)學研究和系統(tǒng)分子學對槭樹科42種進行研究表明：金錢槭是槭樹科中最原始的類群，位于槭樹科系統(tǒng)樹的最基部。而云南金錢槭位于系統(tǒng)樹的中部，是較進化的類群。因此本研究認為：金錢槭較云南金錢槭古老、原始，其進化歷史較云南金錢槭長，在較長的進化過程中積累了更多的遺傳變異。其次，李珊等［6］采用葉綠體DNA對金錢槭屬植物進行的親緣地理學研究發(fā)現(xiàn)，金錢槭具有的葉綠體DNA單倍基因型種類多于云南金錢槭，單倍型分布模式較為復雜，推測冰期時金錢槭存在于多個“避難所”，現(xiàn)今存活的金錢槭來源于多個不同的“避難所”，初始種群間的差異較大，現(xiàn)存?zhèn)€體的遺傳物質多樣化水平高于云南金錢槭。

本研究揭示金錢槭和云南金錢槭兩種間產(chǎn)生了極其顯著的分化，這與前人的研究較一致。廣義形態(tài)學研究和系統(tǒng)分子學研究［19－20］都顯示，云南金錢槭與槭屬內(nèi)部分種聚在一起，而不是直接與其同屬的位于槭樹科系統(tǒng)樹基部的金錢槭聚在一起?？梢?，金錢槭與云南金錢槭確實存在顯著的分化。其產(chǎn)生分化的原因可能是金錢槭和云南金錢槭本身就來源于不同的起源模式。到目前為止，還未發(fā)現(xiàn)云南金錢槭與金錢槭有重疊分布區(qū)，長期的地理隔離也是造成其種間分化加劇的因素之一。

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（編輯：宋亞珍）

Interspecific Differentiation of the Endemic Plant Genus Dipteronia Oliv.

BAI Guoqing1，2，LI Sifeng1，LI Weimin1，LI Zhonghu2，YANG Juan3，ZHAO Guifang2＊
（1Xi’an Botanical Garden of Shaanxi Province／Institute of Botany of Shaanxi Province，Xi’an 710061，China；2Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China，Ministry of Education，College of Life Science，Northwest University，Xi’an 710069，China；3Department of Genetics and Molecular Biology，Medical School of Xi’an Jiaotong University／Key Laboratory of Environment and Disease－related Gene，Ministry of Education，Xi’an 710061，China）

The genus Dipteronia Oliv.（Aceraceae）is endemic in China which consists of two species：D.sinensis Oliv.and D.dyerana Henry.Dipteroniais one of the woody relic genera in the floristic regions of the northern temperate zone.In this study，we carried out a comparative study of D.sinensis Oliv.and D.dyerana Henry.to explore their degree of differentiation between two species from the aspects of morphology，molecular genetics and gene sequence analysis.（1）Morphological studies indicated that the presence of two species in morphological characters have significant differences.（2）Molecular genetic studies based on the AFLP of genomic DNA markers were also used to analyze the two species.And whether they are in species level or group level，the results showed that there was extremely significant genetic differentiation between the two species（ΦST＝0.390 4）.The level of genetic variation and genetic diversity of the two spe－cies have distinct differences（D.sinensis Oliv.＞D.dyerana Henry）.（3）We also downloaded several chloroplast genes（psbM－trnD，trnD－trnT，trnL，trnL－trnF，rpl16）and nuclear gene sequences of ITS（ITS1，5.8SRNA，ITS2）of two known species from GenBank to analyze and compare their differentiation.t－test showed a significant difference between the two species occurred in chloroplast gene sequences.Hence，the results of the present study showed that the D.sinensis Oliv.and D.dyerana Henry have a extremely significant differentiation.And we infer the main reasons of the significant differentiation between the two species attributed to the long－term geographic isolation between them.

Dipteronia sinensis Oliv.；D.dyerana Henry；morphology；molecular genetics；interspecific differentiation

Q789；Q941＋.3

A

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.06.1123

1000－4025（2015）06－1123－06

2014－06－14；修改稿收到日期：2015－05－20

國家自然科學基金（31470311）；教育部博士點基金優(yōu)先發(fā)展領域（20136101130001）；陜西省財政廳項目（2010JM5005）；陜西省科學院科技計劃（2011－K03）

柏國清（1983－），男，在讀博士研究生，助理研究員，主要從事系統(tǒng)與進化植物學研究。E－mail：bgq＠m(xù)s.xab.ac.cn

＊通信作者：趙桂仿，教授，主要從事植物系統(tǒng)進化與分子生態(tài)研究。E－mail：gfzhao＠nwu.edu.cn