梁藝懷，張琨，張京佶，劉敏，趙華清，殷浩文

上海市檢測中心 生物與安全檢測實驗室，上海 201203

青萍生長抑制試驗對稀脈浮萍的適用性研究

梁藝懷，張琨，張京佶，劉敏，趙華清，殷浩文*

上海市檢測中心 生物與安全檢測實驗室，上海 201203

為了驗證我國本土常見的稀脈浮萍(Lemna aequinoctialis)是否適用于以青萍(Lemna minor)作為標準試驗生物的生長抑制試驗，對兩種浮萍的毒性效應終點和毒性響應差異進行比較。通過對兩種浮萍的總葉面積、干重、鮮重同葉狀體數(shù)之間的相關性進行分析，根據(jù)《OECD化學品測試準則No. 221浮萍生長抑制試驗》，遵從良好實驗室規(guī)范(GLP)，將兩種浮萍暴露于參比物質3,5-二氯苯酚，進行7 d更新式毒性試驗，暴露濃度為(1.0～10) mg·L-1。結果表明，青萍的培養(yǎng)條件、試驗方法以及毒性效應終點均適用于稀脈浮萍，兩種浮萍的毒性試驗呈現(xiàn)出相似的時間-效應關系和劑量-效應關系，兩者的毒性效應濃度具有可比性，且數(shù)值上接近。以上實驗結果可以得出，稀脈浮萍適用于生長抑制試驗；鑒于稀脈浮萍在我國分布廣泛、容易獲取，稀脈浮萍可作為毒性測試的國家標準試驗生物。

3,5-二氯苯酚；稀脈浮萍；青萍；生長抑郁；葉狀體數(shù)；總葉面積

化學品的植物毒性鑒別和評價是生態(tài)風險評價的一個基本組成部分。一些工業(yè)化國家和國際組織將其作為化學品管理的一項基本信息，并制定了相應的法規(guī)和標準方法[1-4]。植物毒性評價可利用藻類、水生維管束植物和陸生維管束植物。進入環(huán)境中的化學物質最終都會匯入水生生態(tài)系統(tǒng)中，因此，水生植物的毒性評價特別關鍵[5]。

水生維管束植物是很多水生生態(tài)系統(tǒng)中初級生產者的重要組成部分，它們不僅是是化學物質沉積、遷移和激活(生物有效化)的重要通道，也是水生生態(tài)系統(tǒng)受污染物威脅的重要指示者。到目前為止，最常用于毒性評價的維管束植物是浮萍，它們屬于單子葉植物綱的浮萍科(Lemnaceae)，是一類種子植物，生物學上分類地位比較高等[6,7]。浮萍兼有種子和分株兩種繁殖方式，種子繁殖表明其在植物界中具有高等植物的特征，而分株繁殖使其數(shù)量能在短時間內快速擴增，非常適于作為試驗生物。

目前，已經積累了大量以浮萍科植物作為實驗材料的研究資料。尤其是在環(huán)境基準研究和化學品安全管理中，青萍(Lemna minor)和圓瘤浮萍(Lemna gibba)已在許多國家成為法定的植物毒性測試的標準物種[3,4]。在我國，雖然已有不少研究者利用浮萍從事化學品和污染物的毒性評價[8-16]，但關于浮萍測試技術標準化方面的工作還有所欠缺，尚未深入開展本土種屬適宜性的驗證工作。本研究首次對我國常見的稀脈浮萍(Lemna aequinoctialis)與標準試驗生物青萍(L. minor)進行效應終點以及參比物質3,5-二氯苯酚毒性響應差異的比較分析，為毒性測試方法的國家標準制定提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：超高效液相色譜儀(Waters AcquityTMH-class，美國Waters公司)，光照恒溫培養(yǎng)箱(HZQ-311C，上海一恒科技有限公司)，pH計(HI98128，美國HANNA instruments)，電子分析天平(AL204，瑞士Mettler-Toledo)，照度計(LX100，法國KIMO)，體視顯微鏡(Motic K series，Motic Images Plus 2.0，廈門，麥克奧迪公司)。

試劑：3,5-二氯苯酚(99.9%，Sigma-Aldrich，批號MKBH6101V)。

1.2 受試生物

本研究所用浮萍采自野外，由上海野生動植物鑒定中心認定為青萍和稀脈浮萍，見圖1。將剛采集的浮萍置于清水中振蕩，除去表觀易見的污染物，用0.5%的NaClO溶液滅菌約20 s后，去離子水漂洗3次，置于滅菌容器中，用Steinberg浮萍培養(yǎng)基在實驗室條件下暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間，每周更換培養(yǎng)基兩次，并定期淘汰多余的浮萍，培養(yǎng)8周以上才能用于試驗。

1.3 毒性效應終點的相關性比較

為驗證青萍的毒性測試效應終點是否適用于稀脈浮萍，將兩種浮萍分別按照葉狀體數(shù)9、15、21、27、33、39、45、51進行分組，每組3個平行，根據(jù)《OECD化學品測試準則No. 221浮萍生長抑制試驗》[3]提供的方法依次測定總葉面積、鮮重和干重。將各組總葉面積、鮮重、干重的平均值與葉狀體數(shù)進行Pearson相關分析。

圖1 青萍(a)與稀脈浮萍(b)Fig. 1 L. minor (a) and L. aequinoctialis (b)

1.4 毒性響應差異比較

1.4.1 試驗溶液配制和試驗方式

稱取一定量3,5-二氯苯酚溶解到Steinberg浮萍培養(yǎng)基中，配制成500 mg·L-1的母液，經過Steinberg浮萍培養(yǎng)基稀釋成各濃度試驗溶液。試驗共設置5個暴露濃度組，配制濃度分別為1.0、1.8、3.2、5.6和10 mg·L-1，以及1個Steinberg培養(yǎng)基空白對照組。每組設3個平行，試驗共進行7 d，在第4天對試驗溶液進行更新。

1.4.2 浮萍預培養(yǎng)與接種

試驗前，選擇足量的青萍和稀脈浮萍在試驗條件下培養(yǎng)7 d，保證浮萍處于指數(shù)生長期。

將試驗溶液分裝入滅菌的試驗容器(直徑100 mm、高度45 mm結晶皿)中，每皿150 mL，剩余溶液用于pH值測定。隨機選擇含有2～4片葉狀體的健康浮萍植株(無表面損傷或變色)進行初始接種，每個試驗容器中均為9片葉狀體。

1.4.3 暴露條件

將試驗容器用透明保鮮膜覆蓋后隨機放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，減少不同位置光照與溫度差異對試驗的影響。同時，每次觀測或換液后，隨機放置試驗容器。

試驗期間，培養(yǎng)溫度保持在(23.9～24.3)℃；容器表面保持連續(xù)光照，光照強度在(6 605～6 903) lux，光照強度變化不超過平均光照強度的±15%；對照組溶液的pH變化不超過1.5個單位。

1.4.4 觀察和測定

在試驗開始、溶液更新前后以及結束時測定各試驗溶液的pH值，同時從各組3個平行的試驗溶液中取等體積樣混合后用于濃度分析。

試驗開始時，在試驗培養(yǎng)箱中放置4個僅含培養(yǎng)基的容器，每日測定其溫度。

在試驗開始后0 d、2 d、4 d和7 d對各試驗容器中的浮萍葉狀體數(shù)和總葉面積進行測定，并觀察和記錄異常情況。同時測定培養(yǎng)箱光照強度。

1.4.5 暴露濃度分析

用超高效液相色譜法測定試驗溶液中3,5-二氯苯酚的實際濃度，方法檢出限為0.0530 mg·L-1，信噪比為8.88；定量限為0.106 mg·L-1，信噪比為16.7。0.127和4.24 mg·L-1加標樣品的平均回收率均為104%，精密度值分別為2.59% 和0.53%。建立樣品標準曲線，線性方程為Y=1.41×104X-116，相關系數(shù)為0.9999。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

計算空白對照組葉狀體數(shù)的倍增時間，以確定是否滿足試驗有效性要求。分別計算浮萍葉狀體數(shù)和總葉面積兩個效應終點的平均特定生長率、生長量及其抑制率，并采用Dunnett's Test比較各濃度組與對照組之間的差異?；诟鳚舛冉M的時間加權平均值，通過毒性分析軟件Toxcalc v 5.0.26處理數(shù)據(jù)，用Maximum Likelihood-Probit法估算效應濃度EC10、EC50及其95%置信限。平均特定生長率和生長量的抑制效應濃度分別以ErCx和EyCx來表示。

2 結果(Results)

2.1 毒性效應終點的相關性

兩種浮萍的各效應終點間均具有近似的關系：與葉狀體數(shù)的相關性中，總葉面積>干重>鮮重，即總葉面積與葉狀體數(shù)的相關性最佳(表1)。

表1 青萍和稀脈浮萍的總葉面積、鮮重、干重同葉狀體數(shù)的Pearson相關系數(shù)

2.2 青萍和稀脈浮萍對3,5-二氯苯酚的毒性響應

2.2.1 試驗有效性

按照試驗有效性的要求，對照組葉狀體數(shù)的倍增時間應該小于2.5 d (60 h)，即特定生長率超過0.275 d-1，相當于7 d至少增長7倍。本研究中，青萍和稀脈浮萍對照組葉狀體數(shù)的倍增時間分別為2.1 d和1.6 d，平均特定生長率分別為0.326 d-1和0.430 d-1，故試驗有效。

2.2.2 暴露濃度分析

用超高效液相色譜法測定試驗溶液中3,5-二氯苯酚的實際濃度。如表2所示，除了1.0 mg·L-1濃度組，其他組試驗溶液中樣品實際濃度在更新期間的變化未超出20%，且所有濃度組與各自實測濃度的時間加權平均值的偏離程度均在±20%之內(-12.4%～14.2%)。因此，將各濃度組實測的濃度時間加權平均值用于3,5-二氯苯酚的濃度-效應關系分析。

2.2.3 浮萍異常表征

試驗結束時，兩種浮萍空白對照組的顏色、形態(tài)正常。對于青萍，3.2 mg·L-1組葉狀體變色、根部脫離，而5.6 與10 mg·L-1組均出現(xiàn)葉狀體枯萎、壞死。對于稀脈浮萍，3.2、5.6 與10 mg·L-1組均出現(xiàn)葉狀體枯萎、壞死。

2.2.4 浮萍生長抑制情況

如各濃度組浮萍在試驗期間的生長曲線所示(圖2)，青萍和稀脈浮萍都呈現(xiàn)出相似的時間-濃度-效應關系。期間，兩種浮萍的空白對照組和最低濃度組(1.0 mg·L-1)的葉狀體數(shù)和總葉面積均保持指數(shù)增長，而5.6與10 mg·L-1組在試驗開始2 d后即未觀察到生長。

表2 各濃度組試驗溶液中3,5-二氯苯酚的實測濃度

注：“ND”，未檢出；檢出限為0.0530 mg·L-1；“/”，停止更新，未測定；“—”，不適用。

Note: “ND”, not detected; Limit of detection = 0.0530 mg·L-1; “/”, no measurement due to termination; “—”, not applicable.

圖2 試驗期間3,5-二氯苯酚7 d暴露對青萍(a,b)和稀脈浮萍(c,d)葉狀體數(shù)及總葉面積的影響Fig. 2 Effects of 3,5-dichlorophenol on the frond numbers and total frond areas of L. minor (a,b) and L. aequinoctialis (c,d) during the seven-day test

對于兩種浮萍，無論是葉狀體數(shù)還是總葉面積，除了最低濃度組，其他濃度組的平均特定生長率與生長量同空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(p < 0.05)。因此，在當前試驗條件下，青萍與稀脈浮萍暴露于3,5-二氯苯酚7 d后的無可觀察效應濃度(NOEC，生長抑制效應)值均為0.963 mg·L-1。

根據(jù)平均特定生長率的抑制率，擬合得到兩種浮萍暴露于3,5-二氯苯酚7 d后的濃度-抑制效應曲線(圖3)，從而獲取相應的ErCx值及其95%置信限(表3)；根據(jù)生長量的抑制率，以同樣的方法得到EyCx值及其95%置信限(表4)。與青萍的國際比對試驗結果進行比較發(fā)現(xiàn)，三者在數(shù)值上接近，表明稀脈浮萍作為浮萍生長抑制試驗受試物種的適宜性(表3)。另外，稀脈浮萍的ErCx值與EyCx值均比青萍低，提示前者對3,5-二氯苯酚的敏感性略高。

表3 3,5-二氯苯酚對青萍和稀脈浮萍7 d平均特定生長率的抑制效應濃度(ErCx)

注：#括號內為ErCx的95%置信限，余同；*國際比對結果平均值[2]。

Note:#The values in parentheses stand for 95% confidence limits of ErCx, and others are the same.*the mean values from the results of international interlaboratory tests[2].

圖3 基于葉狀體數(shù)和總葉面積的平均特定生長率，青萍(a,b)和稀脈浮萍(c,d)暴露于3,5-二氯苯酚7 d的濃度-生長抑制效應曲線Fig. 3 Based on specific growth rate of frond number and total frond area, concentration-effect curves for growth inhibition of L. minor (a,b) and L. aequinoctialis (c,d) exposed to 3,5-dichlorophenol for seven days

表4 3,5-二氯苯酚對青萍和稀脈浮萍7 d

3 討論(Discussion)

按照OECD化學品測試準則No. 221[3]的要求，浮萍葉狀體數(shù)是首選的毒性效應終點，另外再從葉面積、干重、鮮重中選擇一個終點進行測定。本研究發(fā)現(xiàn)，與青萍一樣，稀脈浮萍的總葉面積與葉狀體數(shù)的相關性最好，干重次之，鮮重最差(表1)。這一方面與OECD準則規(guī)定的各效應終點優(yōu)先度排序相吻合，另一方面也表明上述效應終點同樣適用于稀脈浮萍。此外，雖然干重或鮮重能夠直接反映生物量的大小，但是需要事先對浮萍進行破壞性的物理處理才能測定，從而無法對同一植株的浮萍進行多次測定和分析從而獲得生長曲線，也難以實現(xiàn)各平行在試驗前后的自身對比。對于葉面積，只要具備簡單的圖像采集和分析系統(tǒng)，即可通過觀測整株浮萍的總葉面積大小來反映其生物量的大小，能夠滿足在不同試驗時點的觀測要求。青萍和稀脈浮萍均為漂浮植物，整個葉面位于水平面，很少重疊，有利于葉面積的測定。因此，在隨后的毒性試驗中，選擇總葉面積作為葉狀體數(shù)的輔助終點。

為了比較兩種浮萍對參比物質3,5-二氯苯酚的毒性響應情況，本研究遵從GLP實驗室規(guī)范，采用OECD化學品測試準則No. 221[3]進行了浮萍生長抑制試驗。以葉狀體數(shù)和總葉面積作為效應終點，兩種浮萍表現(xiàn)出相似的時間-效應關系和濃度-效應關系。根據(jù)平均特定生長率分別估算出3,5-二氯苯酚對兩種浮萍的毒性效應濃度ErCx，同國際比對試驗報告的結果具有可比性，且數(shù)值上接近。這既說明試驗過程的質量保證符合要求，還表明稀脈浮萍對3,5-二氯苯酚的毒性響應程度與青萍處于相同水平。實驗室內部關于化學品或廢水測試的歷史研究數(shù)據(jù)也表明，稀脈浮萍的參比試驗結果具有穩(wěn)定性和可重復性。

ISO 20079[2]指出，Steinberg培養(yǎng)基僅可用于青萍的培養(yǎng)，但經過長達一年的實驗室暫養(yǎng)實踐表明，該培養(yǎng)基對稀脈浮萍同樣適用，期間浮萍生長健康、無異常表觀。本研究也顯示，稀脈浮萍在與青萍相同的培養(yǎng)和試驗條件下，能夠獲得可靠的試驗結果。針對金屬化合物和含金屬廢水的毒性測試，ISO 20079[2]還建議采用APHA 培養(yǎng)基。另外，通過氯化鉀參比試驗證實該培養(yǎng)基對稀脈浮萍的適用性的工作正在順利進行，結果將在其他文章中詳細闡述。

本研究從浮萍生長抑制試驗的技術標準化出發(fā)，驗證了我國本土浮萍種屬的適用性。在浮萍科的4個屬中，浮萍屬(Lemna L.)在毒性測試中是最常見的[6]，其中青萍(L. minor)和圓瘤浮萍(L. gibba)得到了OECD[3]和美國環(huán)保署[4]的推薦，但并未排斥使用其他浮萍屬植物。而植物分布具有地域特征，即地理差異使得各地區(qū)具有不同的植物區(qū)系組成。利用本土植物更具本土植物區(qū)系代表性，更能反映本土植物對環(huán)境的適應特點。因此，在制定國家標準時，既要選取國際上廣泛認可的青萍作為標準試驗生物，也應該對分布廣泛的其他浮萍種進行適用性檢驗，作為備選材料，以滿足我國不同地域的需要。

我國目前已發(fā)現(xiàn)的浮萍屬中包括青萍、稀脈浮萍和三叉浮萍(L. trisulca)3個種[17]，南北分布差異較大。如上海地區(qū)目前發(fā)現(xiàn)有青萍和稀脈浮萍，北京地區(qū)既有青萍又有三叉浮萍，而在東北和云南3種都有。由于三叉浮萍是一種懸浮植物，常聚成團或層片，僅在開花時浮至水面，不利于葉狀體計數(shù)和葉面積測量，故不宜作為標準試驗生物。而稀脈浮萍的物種特征與青萍較為接近，是適宜的候選試驗生物。

傳統(tǒng)上，由于藻類培養(yǎng)系統(tǒng)的簡易性使之成為主要的水生植物毒性評價試驗生物，將它們的毒性數(shù)據(jù)外推到水生維管束植物和陸生植物的來使用。然而，有數(shù)據(jù)表明在20%的測試中藻類敏感性不如維管束植物[6]。另外，與藻類相比，利用以浮萍為代表的水生維管束植物進行毒性評價有兩大優(yōu)勢：一是應用范圍更廣，除了化學品測試，還可以用于幾乎所有樣品，比如各類工業(yè)和城市排放廢水、垃圾或礦堆滲透液，尤其是對那些因為渾濁和有顏色而不能使用藻類進行測試的復雜樣品；二是可以采用更新或流水方式進行試驗，這對于那些毒性不穩(wěn)定或隨時間變化的樣品而言非常重要[18]。因此，有必要建立基于本土浮萍的試驗技術標準，為我國化學品測試和環(huán)境基準研究提供可靠手段。

綜上所述，在浮萍生長抑制試驗中，青萍的培養(yǎng)條件、試驗方法和毒性效應終點均適用于稀脈浮萍。稀脈浮萍在我國分布廣泛，容易獲取，可作為毒性測試的國家標準試驗生物。

致謝：感謝華東師范大學生命科學學院李宏慶教授的幫助和支持。

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◆

The Applicability ofLemnaaequinoctialisto Growth Inhibition Test ofLemnaminor

Liang Yihuai, Zhang Kun, Zhang Jingji, Liu Min, Zhao Huaqing, Yin Haowen*

Bioassay and Safety Assessment Laboratory, Shanghai Academy of Public Measurement, Shanghai 201203, China

18 March 2014 accepted 20 May 2014

To validate whether native Lemna aequinoctialis (commonly found in China) is suitable for the growth inhibition test using Lemna minor as standard test organism, these two Lemna species were compared regarding to the measured toxicity endpoints and the difference in responses to chemical exposure. The correlations of total frond area, fresh weight and dry weight with frond number of L. minor and L. aequinoctialis were investigated. In compliant with Good Laboratory Practices (GLP), a seven-day semi-static toxicity test was performed using the two duckweeds exposed to 3,5-dichlorophenol (as reference substance) at concentrations from 1.0 mg L-1to 10 mg L-1, according to "OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 221 Lemna sp. Growth Inhibition Test". It was found that cultivation conditions, test procedures and toxicity endpoints for L. minor were applicable to L. aequinoctialis. The test of the two duckweeds showed the similar time-effect relationship as well as the dose-effect relationship; and those effect concentrations at each level were comparable and approximate. In conclusion, L. aequinoctialis can serve as test organisms as L. minor. L. aequinoctialis can become a candidate of the national standard species in toxicity testing.

3,5-dichlorophenol； Lemna aequinoctialis; Lemna minor; growth in hibition; frond number; total frond area

上海市科學技術委員會技術標準專項(12DZ0502600)

梁藝懷(1981-)，男，醫(yī)學博士，主要研究方向為化學品風險評價、毒理學和生態(tài)毒理學，E-mail: liangyh@apm.sh.cn；

*通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yinhw@apm.sh.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20140318001

2014-03-18 錄用日期：2014-05-20

1673-5897(2015)1-305-07

X171.5

A

殷浩文 (1959—)，男，教授級高級工程師，主要研究方向為化學品風險評價和生態(tài)毒理學，發(fā)表學術論文40余篇，專著及合著6部。

梁藝懷，張琨，張京佶，等. 青萍生長抑制試驗對稀脈浮萍的適用性研究[J]. 生態(tài)毒理學報，2015, 10(1): 305-311

Liang Y H, Zhang K, Zhang J J, et al. The applicability of Lemna aequinoctialis to growth inhibition test of Lemna minor [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(1): 305-311 (in Chinese)