李 朕，胡文濤，唐 明

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵712100；2西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊陵712100）

叢枝菌根真菌對(duì)刺槐幼苗機(jī)械損傷響應(yīng)機(jī)制的初步研究

李 朕1，胡文濤1，唐 明2＊

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵712100；2西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西楊陵712100）

通過(guò)對(duì)刺槐幼苗每隔3d剪去1片葉片造成持續(xù)機(jī)械損傷，測(cè)定了0～138h抗氧化酶活性變化及刺槐幼苗生長(zhǎng)情況；同時(shí)使用孔徑25μm尼龍網(wǎng)設(shè)置三室根箱隔網(wǎng)系統(tǒng)，測(cè)定了供體瞬時(shí)機(jī)械損傷后受體的抗氧化酶活性的持續(xù)變化，探討接種叢枝菌根真菌刺槐幼苗對(duì)持續(xù)及瞬時(shí)機(jī)械損傷后的響應(yīng)機(jī)制，以及菌根菌絲橋?qū)Υ袒庇酌鐧C(jī)械損傷信號(hào)的傳遞特征。結(jié)果表明：在持續(xù)機(jī)械損傷脅迫下，接種叢枝菌根真菌能夠促進(jìn)刺槐幼苗的根系生長(zhǎng)、提高幼苗的成活率，接種叢枝菌根真菌的刺槐幼苗成活率及根系鮮重比對(duì)照分別增加15.38%和23.52%。瞬時(shí)機(jī)械損傷后0、48、90、114、138h刺槐幼苗的苯丙氨酸解氨酶（PAL）和過(guò)氧化物酶（POD）活性都呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，均在90h達(dá)到最大值，并且菌根化幼苗的PAL和POD活性顯著高于未菌根化幼苗。瞬時(shí)機(jī)械損傷后，菌根菌絲橋能夠介導(dǎo)刺槐幼苗間相關(guān)信號(hào)的傳遞，從而引起菌根化受體刺槐幼苗的PAL和POD活性表現(xiàn)出與供體機(jī)械損傷幼苗相同的變化趨勢(shì)。

刺槐；叢枝菌根真菌；機(jī)械損傷；菌根菌絲橋

刺槐（Robinia pseudoacacia L.）在中國(guó)西北地區(qū)分布廣泛，是耐寒、耐旱、耐濕、耐鹽堿，抗逆性極強(qiáng)的喬木，具有很好的水土保持、防風(fēng)固沙作用，因此成為中國(guó)西北黃土高原生態(tài)脆弱區(qū)沙漠化土壤改良的優(yōu)良樹種。然而西北風(fēng)沙地區(qū)沙塵暴頻繁，幼苗在移栽過(guò)程中受到風(fēng)沙造成的機(jī)械損傷不可避免，加之干旱失水、溫度等多種因子的限制，嚴(yán)重影響幼苗的成活［1］。尤其是風(fēng)沙侵襲與動(dòng)物取食等對(duì)幼苗造成的機(jī)械損傷，伴隨著病蟲害入侵，對(duì)幼苗的成活與生長(zhǎng)危害更大。

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌廣泛分布于自然界中，能夠與絕大多數(shù)維管植物根系形成互惠共生結(jié)構(gòu)［2］。AM真菌能夠提高植物的營(yíng)養(yǎng)與水分的吸收利用［3］，與其它土壤微生物協(xié)同促進(jìn)植株生長(zhǎng)［4］，增強(qiáng)植物抗逆性［3，5］。AM真菌的根外菌絲在土壤中擴(kuò)展時(shí)，可以繼續(xù)侵染其它植株，在植株之間形成菌根菌絲橋［6］，植株之間通過(guò)菌根菌絲橋進(jìn)行物質(zhì)傳遞和信號(hào)的傳輸［7-9］。

目前，付淑清等［10］接種AM真菌顯著提高了刺槐生長(zhǎng)狀況和營(yíng)養(yǎng)水平，杜小剛等［11］和劉振坤等［12］研究了不同樹齡刺槐叢枝菌根根際微生物的群落多樣性、AM真菌空間分布與根際土壤因子的關(guān)系，徐輝等［13］研究表明，AM真菌增加了陜北府谷砒砂巖區(qū)生長(zhǎng)的刺槐對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，增強(qiáng)了其耐旱、耐鹽能力。但是關(guān)于接種AM真菌的刺槐受到機(jī)械損傷后的響應(yīng)及菌根菌絲橋?qū)τ跈C(jī)械損傷信號(hào)傳導(dǎo)的研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)刺槐幼苗模擬機(jī)械損傷，研究了接種AM真菌的植株和菌根菌絲橋介導(dǎo)的植株機(jī)械損傷后抗氧化酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）與過(guò)氧化物酶（POD）活性變化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌劑 供試AM真菌為摩西球囊霉（Funneliformis mosseae，原名Glomus mosseae）和根內(nèi)球囊霉（Rhizophagus intraradices，原名Glomus intraradices）［14］。菌種由北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所提供，經(jīng)三葉草（Trifolium repens）擴(kuò)繁（孢子密度R.intraradices為16.4個(gè)／g，F(xiàn).mosseae為12.6個(gè)／g），將2種菌劑按照體積1∶1混合為供試菌劑。

1.1.2 供試植物 挑選飽滿的刺槐種子（陜西省林業(yè)技術(shù)推廣總站提供），用0.5%KMnO4溶液浸泡20min進(jìn)行表面消毒，蒸餾水沖洗3次、無(wú)菌水浸泡24h后，置于鋪有紗布的托盤上，在25℃光照培養(yǎng)箱中催芽，每天光照14h、換1次水。當(dāng)種子胚根伸出約0.1cm時(shí)將種子播種在裝有滅菌蛭石的育苗缽中（47cm×33cm，66孔），每孔播種3～4粒，將育苗缽置于25℃光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天早上澆水（20mL／孔），待幼苗長(zhǎng)至3cm時(shí)挑取長(zhǎng)勢(shì)一致的進(jìn)行移栽。

1.1.3 供試基質(zhì) 供試土壤采自西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院苗圃，過(guò)2mm篩，121℃、0.11MPa高壓蒸汽滅菌2h；河沙過(guò)2mm篩，170℃干熱滅菌4 h。將無(wú)菌土與河沙以體積比1∶1混合均勻作為供試基質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 機(jī)械損傷后刺槐幼苗根系鮮重、成活率和PAL、POD活性測(cè)定 將供試基質(zhì)裝在15cm×13 cm的塑料盆中（2kg／盆），于基質(zhì)表層下2cm處接種100g混合菌劑，每盆移栽1棵刺槐幼苗，以施等量滅菌劑作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)50盆，按照完全隨機(jī)區(qū)組排列。置于25～35℃培養(yǎng)，每天光照12 h、澆水200mL／盆，每2周澆1次Hoagland營(yíng)養(yǎng)液（200mL／盆）。培養(yǎng)4周后進(jìn)行瞬時(shí)機(jī)械損傷和持續(xù)機(jī)械損傷處理：各持續(xù)機(jī)械損傷處理每隔3d從植株上隨機(jī)剪去1片葉片，造成持續(xù)機(jī)械損傷，持續(xù)損傷2個(gè)月后測(cè)定刺槐幼苗成活率、根系鮮重和菌根侵染率；各瞬時(shí)機(jī)械損傷處理幼苗被剪去1片葉片后分別在0、42、90、114和138h測(cè)定PAL、POD活性。

1.2.2 機(jī)械損傷刺槐幼苗間信號(hào)傳導(dǎo)試驗(yàn) 采用三室根箱隔網(wǎng)（25μm孔徑尼龍網(wǎng)，菌絲可穿過(guò)，根系不能通過(guò)）裝置［15］，高15cm、寬10cm，兩邊室（A、B室）長(zhǎng)3cm，中室（C室）長(zhǎng)2cm（圖1）。將供試基質(zhì)裝在根箱中（4kg／箱），刺槐幼苗移栽至A、B室。接種方法和培養(yǎng)條件同上，每個(gè)處理30箱。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理（表1），其中處理Ⅱ、處理Ⅲ和處理Ⅳ為對(duì)照，以分別排除由于根系分泌物、液體流動(dòng)、地上部分氣體揮發(fā)物等原因造成的信號(hào)傳導(dǎo)的可能性［16］。

培養(yǎng)2個(gè)月后測(cè)定菌根侵染率，然后對(duì)A室植株（供體植株）每株隨機(jī)剪去5片葉片造成機(jī)械損傷，每處理于損傷后0、42、90、114和138h隨機(jī)選取5株B室植株（受體植株）進(jìn)行POD和PAL活性檢測(cè)［17］，并檢測(cè)A、B室菌根侵染率。

舒適護(hù)理能夠有效改善護(hù)患關(guān)系，緩解患者恐懼、焦慮以及緊張等不良心理，從而以平穩(wěn)的心態(tài)面對(duì)手術(shù)治療，提升治療效果。本次研究具體探究了將舒適護(hù)理應(yīng)用在手術(shù)室護(hù)理工作中的臨床效果，觀察組患者手術(shù)后的焦慮評(píng)分情況、發(fā)生并發(fā)癥的幾率以及對(duì)護(hù)理工作的滿意度明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

1.3 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.3.1 幼苗成活率與根系鮮重 統(tǒng)計(jì)接種與對(duì)照刺槐幼苗成活率。每處理存活植株中隨機(jī)選取5株，從盆中小心取出刺槐幼苗，剪取根系部分，洗凈基質(zhì)、擦干后稱量根系鮮重。

1.3.2 菌根侵染率 對(duì)各處理的苗木，隨機(jī)選取5株，取全部根系，用清水輕輕沖洗干凈，選取直徑小于2mm的根系，剪成0.5～1.0cm長(zhǎng)的根段，進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色［18］。顯微鏡觀察根段內(nèi)侵染的菌絲、泡囊或叢枝，共檢查150個(gè)根段。統(tǒng)計(jì)真菌侵染的根段長(zhǎng)度，計(jì)算菌根侵染率［19］。

圖1 三室根箱隔網(wǎng)系統(tǒng)Fig.1 Three-partments system

表1 三室根箱隔網(wǎng)系統(tǒng)處理Table 1 Treatments of three-partments system

菌根侵染率（%）＝（有真菌侵染的根段長(zhǎng)度／檢查根段總長(zhǎng)度）×100%

1.3.3 POD、PAL活性 對(duì)接種和對(duì)照各處理的苗木，機(jī)械損傷后0、42、90、114和138h隨機(jī)選取5株，每株采集植株上部第4、5、6片完全展開葉，蒸餾水沖洗3次，擦干后采用高俊鳳［17］方法測(cè)定PAL與POD活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)整理后，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析（One-way ANOVA），繪圖用Sigmaplot 10.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌對(duì)機(jī)械損傷幼苗根系鮮重和成活率的影響

對(duì)機(jī)械損傷處理刺槐幼苗培養(yǎng)2個(gè)月后，統(tǒng)計(jì)刺槐幼苗成活率、測(cè)定根系鮮重和菌根侵染率，結(jié)果見表2。在機(jī)械損傷的情況下，接種菌根真菌幼苗的平均菌根侵染率為91.57%；與對(duì)照植株相比，其幼苗成活率提高15.38%，根系鮮重提高23.52%（P≤0.05）。說(shuō)明接種AM真菌能夠促進(jìn)機(jī)械損傷的刺槐幼苗根系更好地發(fā)育，使根系鮮重顯著增加，提高了機(jī)械損傷刺槐幼苗的成活率。

2.2 AM真菌對(duì)機(jī)械損傷幼苗葉片POD、PAL活性的影響

從表3可以看出，接種與對(duì)照的刺槐幼苗機(jī)械損傷后POD和PAL活性變化現(xiàn)趨勢(shì)相同，即先升高后降低，并在機(jī)械損傷后90h達(dá)到最大值，之后開始降低，機(jī)械損傷后活性增加，表明機(jī)械損傷處理能夠引起刺槐幼苗防御反應(yīng)，導(dǎo)致POD和PAL活性的增加。但是同時(shí)也發(fā)現(xiàn)接種幼苗的POD和PAL活性均高于對(duì)照，POD活性在0、4 2、1 1 4和138h分別比對(duì)照高出24.14%、22.13%、33.16%和10.94%，PAL活性則分別高出59.20%、19.42%、25.36%和30.15%，且大多均差異顯著（P≤0.05，n＝5）。說(shuō)明接種AM真菌能夠使POD和PAL活性顯著提高，增強(qiáng)刺槐幼苗對(duì)機(jī)械損傷的防御反應(yīng)能力，對(duì)于野外環(huán)境中刺槐在機(jī)械損傷后的正常生長(zhǎng)有積極的作用。

表2 機(jī)械損傷后刺槐幼苗的菌根侵染率、成活率和根系鮮重Table 2 The infection rate，survival rate and average root fresh weight of black locust seedlings after continuous mechanical damage

2.3 機(jī)械損傷信號(hào)在幼苗間的傳遞途徑

對(duì)根箱隔網(wǎng)系統(tǒng)菌根侵染率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（圖2）表明，A室植株菌根真菌平均侵染率為89.8%，B室為85.6%，表明AM真菌已與刺槐幼苗形成了良好共生結(jié)構(gòu)，建立了共生關(guān)系。

菌根菌絲橋介導(dǎo)的機(jī)械損傷信號(hào)對(duì)受體植株（B室）POD和PAL活性隨時(shí)間變化情況見圖3。其中，處理Ⅰ和Ⅲ中受體刺槐幼苗的PAL和POD活性隨時(shí)間先增加后降低，處理Ⅱ和Ⅳ中的受體刺槐幼苗的PAL和POD活性隨時(shí)間基本無(wú)變化。接種處理Ⅰ（不套袋）和處理Ⅲ（套袋）供體植株與受體植株間存在菌根菌絲橋，處理Ⅲ（套袋）隔斷氣體揮發(fā)物；而處理Ⅱ（接種、C室塑料泡沫板隔斷）和處理Ⅳ（不接種）供體和受體植株間傳遞根系分泌物和無(wú)法形成菌根菌絲橋（表1），上述的受體植株P(guān)AL和POD活性變化趨勢(shì)表明，刺槐幼苗間能夠傳遞機(jī)械損傷信號(hào)，且這種信號(hào)傳遞是通過(guò)菌根菌絲橋而不是根系分泌物、氣體揮發(fā)物。

表3 AM真菌對(duì)機(jī)械損傷幼苗POD、PAL活性的影響Table 3 Activities of POD and PAL of black locust seedlings after continuous mechanical damage

圖2 持續(xù)機(jī)械損傷處理后A室和B室刺槐幼苗根系的菌根侵染率Ⅰ～Ⅳ處理方法見表1Fig.2 Infection rate of plants in A and B partments after continuous mechanical damageⅠ-Ⅳtreatment same as Table 1

圖3 B室植株P(guān)AL活性（A）和POD活性（B）Fig.3 Activities of PAL（A）and POD（B）of plants in B partment

2.4 菌根菌絲橋介導(dǎo)的機(jī)械損傷信號(hào)對(duì)POD和PAL活性的影響

對(duì)能夠形成菌根菌絲橋的處理Ⅰ和處理Ⅲ與無(wú)菌根菌絲橋的處理Ⅳ（未接菌）的受體植株P(guān)AL與POD活性隨時(shí)間的變化進(jìn)行比較（表4），結(jié)果表明，處理Ⅰ和處理Ⅲ中B室受體刺槐幼苗PAL活性在機(jī)械損傷后42、90、114、138h分別比損傷處理前顯著增加了204.1%和222.0%、355.6%和320.2%、155.7%和145.4%、184.6%和102.3%，均顯著高于處理Ⅳ中同期的受體刺槐幼苗，而處理Ⅰ和處理Ⅲ之間PAL活性無(wú)顯著差異。同樣，處理Ⅰ和處理Ⅲ中B室受體刺槐幼苗POD活性在機(jī)械損傷后42、90、114、138h分別比損傷處理前顯著增加了12.0%和26.0%、48.6%和46.4%、25.2%和6.0、16.1%和4.6%。同時(shí)，處理Ⅰ與處理Ⅳ中受體植株P(guān)OD活性在0、42、114和138h沒(méi)有顯著差異，但在90h比處理Ⅳ顯著增加了37.7%；處理Ⅲ與處理Ⅳ中受體植株P(guān)OD活性在0、114和138h時(shí)沒(méi)有顯著差異，但在42h和90h處理Ⅲ比處理Ⅳ分別顯著增加了26.8%和46.5%；機(jī)械損傷后受體POD活性同期處理Ⅰ與處理Ⅲ無(wú)顯著差異。以上結(jié)果說(shuō)明是菌根菌絲橋，并非揮發(fā)物質(zhì)，能夠介導(dǎo)刺槐幼苗間機(jī)械損傷信號(hào)并引起受體植株P(guān)OD和PAL活性改變。

表4 B室植株P(guān)AL和POD活性Table 4 Activities of PAL and POD of plants in B partment

3 討 論

大量研究表明，AM真菌能夠促進(jìn)植物根系的分枝與生長(zhǎng)，改善植物營(yíng)養(yǎng)狀況，增加植物根際酶活性，提高植物光合特性等作用來(lái)增強(qiáng)植物對(duì)干旱、鹽堿、病害等抗性［20-23］。本研究結(jié)果表明：接種AM真菌的刺槐幼苗接受機(jī)械損傷后，與不接種幼苗相比，根系鮮重顯著增加，POD和PAL活性顯著提高，進(jìn)而提高了幼苗成活率。這可能是由于接種AM真菌增加了刺槐植株生物量，增強(qiáng)了樹勢(shì)［24］；同時(shí)，植株P(guān)OD和PAL活性的提高，有利于減輕植株受到脅迫造成的過(guò)氧化損傷［25］，使得植株在受到脅迫后能更好地生長(zhǎng)，對(duì)持續(xù)的機(jī)械損傷表現(xiàn)出更強(qiáng)的適應(yīng)性。

有研究發(fā)現(xiàn)，14C可以通過(guò)菌絲橋從標(biāo)記的植株（供體植株）向檢測(cè)的植株（受體植株）體內(nèi)轉(zhuǎn)移，且該轉(zhuǎn)移過(guò)程受生理過(guò)程的調(diào)節(jié)［9，26］。植物可以利用菌根菌絲橋通過(guò)茉莉酸途徑等傳遞植物間抗病、抗蟲信號(hào)引起植株的防御反應(yīng)［7，27］，但關(guān)于菌根菌絲橋?qū)τ跈C(jī)械損傷信號(hào)的傳遞未見報(bào)道。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)排除了根系分泌物、液體流動(dòng)與氣體揮發(fā)物的影響，發(fā)現(xiàn)接種AM真菌不僅能夠引起機(jī)械損傷刺槐幼苗POD和PAL活性的顯著提高，而且還可通過(guò)菌根菌絲橋傳遞的相應(yīng)信號(hào)，引發(fā)周圍刺槐幼苗的POD和PAL活性的提高，使周圍植物提前對(duì)機(jī)械損傷做好準(zhǔn)備。

由此可見，AM真菌能夠幫助刺槐幼苗緩解機(jī)械損傷造成的影響，且菌根菌絲橋能夠介導(dǎo)刺槐幼苗間的機(jī)械損傷信號(hào)的傳導(dǎo)。這對(duì)于中國(guó)西北荒漠化地區(qū)的刺槐幼苗在遭受風(fēng)沙或者動(dòng)物取食造成的機(jī)械損傷后更快、更強(qiáng)地產(chǎn)生防御反應(yīng)，修復(fù)損傷，提高其成活率，加快中國(guó)西北地區(qū)生態(tài)恢復(fù)具有重要意義。

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（編輯：裴阿衛(wèi)）

Basic Research on Response of Arbuscular Mycorrhizal Fungi to Robinia pseudoacacia L.Seedling with Mechanical Damage

LI Zhen1，HU Wentao1，TANG Ming2＊
（1College of Life Sciences，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China；2College of Forestry，Northwest A＆F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）

In this study，we tested the response of black locust（Robinia pseudoacacia L.）with instantaneous and continuous mechanical damage to the arbuscular mycorrhizal（AM）fungi，and using three-partments system tested the role of common mycorrhizal networks（CMNs）in transmitting mechanical damage related signal between black locust seedlings.We set seedlings with a leaf cut and with a leaf cut every 3 days as the instantaneous and continuous mechanical damaged treatments，respectively，and tested the POD，PAL activities at 0-138hand growth of the seedlings.Meanwhile，we used three-partments system with 25μm nylon net to test POD and PAL activities of receptor plants after the donor plants suffered the instantaneous and continuous mechanical damage.The results showed that AM fungi can promote root growth and improve the ratio of transplanting survival of the seedlings with continuous mechanical damages.Suffering from instantaneous mechanical damage，the activities of L-phenylalanin ammo-nialyase（PAL）and peroxidase（POD）increased for 90hand then decreased.Also，the PAL and POD activities ofmycorrhizal seedlings were significantly higher than that of the non-mycorrhizal seedlings.And CMNs can transmit signals relating to mechanical damage，resulting in alteration of PAL and POD activities of donor plants.

Robinia pseudoacacia L.；arbuscular mycorrhizal（AM）fungi；mechanical damage；common mycorrhizal networks（CMNs）

Q945.79

A

10.7606／j.issn.1000-4025.2015.07.1437

1000-4025（2015）07-1437-06

2014-12-03；修改稿收到日期：2015-05-22

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201404217）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31170567，31270639）；長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（IRT1035）

李 朕（1990-），男，在讀博士研究生，主要從事微生物生態(tài)研究。E-mail：15109241277＠163.com

＊通信作者：唐 明，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事森林微生物學(xué)的研究。E-mail：tangmingyl＠163.com