李小琴，解雁飛

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，陜西 延安716000)

AQP-8和Caspase7在羊水過(guò)少孕婦胎膜組織中的表達(dá)

李小琴，解雁飛

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科，陜西 延安716000)

目的 探討水通道蛋白-8(AQP-8)和凋亡蛋白Caspase7在羊水量過(guò)少產(chǎn)婦和羊水量正常的產(chǎn)婦胎膜中的表達(dá)差異。方法 采用免疫組化方法(SP法)分別檢測(cè)30例羊水量過(guò)少實(shí)驗(yàn)組和30例羊水量正常對(duì)照組產(chǎn)婦胎膜組織中AQP-8和Caspase7的蛋白表達(dá)水平，并分析這兩種蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果 AQP-8和Caspase7蛋白在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組產(chǎn)婦的胎膜中均有陽(yáng)性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組胎膜中的AQP-8蛋白表達(dá)水平明顯比對(duì)照組低，Caspase7的表達(dá)卻明顯比對(duì)照組高，而兩者的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.56、2.60，均P<0.05)；同時(shí)AQP-8與Caspase7在實(shí)驗(yàn)組胎膜細(xì)胞中的表達(dá)卻呈負(fù)相關(guān)(r=-0.66，P<0.05)。結(jié)論 羊水量過(guò)少孕婦胎膜中AQP-8蛋白的低表達(dá)與Caspase7蛋白的高表達(dá)，提示AQP-8和Caspase7在產(chǎn)婦胎膜中的異常表達(dá)可能是羊水過(guò)少發(fā)生的原因之一。

羊水過(guò)少；胎膜；水通道蛋白；凋亡蛋白；免疫組織化學(xué)

臨床上將妊娠晚期(妊娠期超過(guò)28周)羊水量少于300mL者稱為羊水過(guò)少[1]。羊水過(guò)少是婦產(chǎn)科常見(jiàn)的妊娠合并癥，可明顯使孕婦剖宮產(chǎn)率增高，同時(shí)增加了圍生兒的患病率和死亡率。羊水過(guò)少會(huì)使宮縮時(shí)子宮與胎兒之間的緩沖減少，臍帶也容易受壓，使胎兒發(fā)生宮內(nèi)缺氧率大大增加[2]；同時(shí)羊水過(guò)少可使肺的膨脹減小，從而阻礙肺的發(fā)育，使新生兒窒息率增加[3]。目前仍有一部分羊水過(guò)少的病因尚不明確，因此通過(guò)研究羊水平衡的調(diào)控對(duì)預(yù)防、診斷和治療羊水過(guò)少有著重要意義。

近年來(lái)，水通道蛋白(aquaporin，AQP)與凋亡蛋白Caspase在孕婦胎盤(pán)胎膜上的分布及其與羊水量調(diào)節(jié)關(guān)系的研究已漸漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。AQP作為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的通道之一，可能參與孕婦體內(nèi)的羊水平衡調(diào)控，參與母胎之間的液體交換；Caspase7作為一種凋亡效應(yīng)Caspase，是細(xì)胞凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白酶，也是細(xì)胞凋亡途徑中蛋白酶聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，其在孕婦胎盤(pán)胎膜細(xì)胞中的正常表達(dá)能確保其正常有序的凋亡，從而維持著母胎之間的物質(zhì)交換，保證胎兒的正常發(fā)育。因此，本研究通過(guò)運(yùn)用免疫組化的方法檢測(cè)AQP-8和Caspase7在羊水量正常和羊水過(guò)少孕婦胎膜中的表達(dá)差異及其相關(guān)性，進(jìn)一步探討羊水過(guò)少的病因。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選擇2013年6至11月在延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院的足月孕(37～41周)擇期剖宮產(chǎn)分娩的羊水量正常產(chǎn)婦30例為羊水量正常對(duì)照組；隨機(jī)選取同期在延安大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科住院的足月孕(37～41周)剖宮產(chǎn)分娩的羊水量過(guò)少產(chǎn)婦30例為羊水量過(guò)少實(shí)驗(yàn)組。診斷標(biāo)準(zhǔn)以謝幸主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》(2013年第8版)為準(zhǔn)。

此外，兩組均排除合并妊娠期高血壓疾病、胎膜早破、胎兒窘迫、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限、胎兒畸形及其他并發(fā)癥，無(wú)藥物服用史，無(wú)縮宮素引產(chǎn)史及母體脫水等因素。本研究得到本院倫理委員會(huì)的支持，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本的采集和選擇

常規(guī)消毒鋪巾下，行子宮下段剖宮產(chǎn)術(shù)，在胎盤(pán)娩出后10min內(nèi)分離胎盤(pán)胎膜組織，力求保持組織新鮮，勿使其干燥，取胎膜約2.0cm×2.0cm大小，將胎膜標(biāo)本置于0.9%的生理鹽水中漂洗3次，去除血凝塊及血液，置于4%的多聚甲醛緩沖固定液中固定并編號(hào)。固定后充分水洗已固定的胎膜標(biāo)本，以減少固定液造成的人為假象，并將其置于已標(biāo)號(hào)的組織盒中蓋緊，于全自動(dòng)脫水機(jī)中常規(guī)酒精脫水。行石蠟包埋組織塊，浸蠟。

1.3 研究方法及結(jié)果判定

1.3.1 免疫組化方法

1.3.1.1 石蠟組織的處理 取出已制備好并保存在冰箱中的石蠟組織塊，并請(qǐng)延安大學(xué)附屬醫(yī)院病理科的資深切片專家連續(xù)切片2張。用多聚賴氨酸粘附載玻片將組織薄片固定并標(biāo)記后，將切片依次置入二甲苯中脫蠟、梯度酒精中水化、蒸餾水洗沖。最后用已配制好的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，將切片置于耐高溫染色架后放入蒸餾水中，防止切片干燥，以待抗原修復(fù)。

1.3.1.2 本實(shí)驗(yàn)操作步驟 嚴(yán)格按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：①根據(jù)第一抗體的要求，對(duì)胎膜組織進(jìn)行抗原熱修復(fù)；②消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。向免疫組化染色孵育盒底添加少量蒸餾水，將切片依次置入孵育盒里，然后向切片上的組織快速滴加過(guò)氧化氫溶液，將孵育盒蓋嚴(yán)后置入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20min，然后取出孵育盒，將切片用PBS沖洗；③滴加一抗抗體稀釋液。按照說(shuō)明書(shū)將0.1mL的蒸餾水分別加入兔抗人AQP-8抗體及兔抗人Caspase7抗體(凍干粉)中，溶解混勻后制備成抗體原液，隨后配制一抗抗體稀釋液(抗體原液與PBS的比例為1:300)。向切片上的組織快速滴加適量的一抗抗體稀釋液后，室溫下孵育60min后，PBS緩沖液沖洗；④滴加二抗。將切片放置在免疫組化孵育盒上，向切片快速滴加二抗，置于室溫下孵育20min后，用PBS緩沖液沖洗；⑤顯色液(DAB)顯色。將切片放置在免疫組化孵育盒上，向切片依次快速滴加適量已配制好的新鮮DAB顯色試劑，室溫下染色約3～5min后蒸餾水沖洗終止顯色；⑥復(fù)染、脫水、透明及封片。將切片置入蘇木素染液中進(jìn)行復(fù)染，把復(fù)染后的組織切片依次放入梯度酒精中脫水，二甲苯中透明，最后滴加中性樹(shù)膠的同時(shí)加載蓋玻片封片并粘貼標(biāo)簽。

1.3.2 結(jié)果的判定

以鏡下在細(xì)胞內(nèi)看到棕色或黃色顆粒者作為判定陽(yáng)性細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察所選擇視野中的所有細(xì)胞，同時(shí)記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)(陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)算的胎膜細(xì)胞數(shù))，然后計(jì)分(P)：0分為<5%的胎膜滋養(yǎng)細(xì)胞呈陽(yáng)性；1分為5%～10%的胎膜細(xì)胞呈陽(yáng)性；2分為11%～50%的胎膜細(xì)胞呈陽(yáng)性；3分為>50%的胎膜細(xì)胞呈陽(yáng)性。同時(shí)對(duì)多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)的棕黃色計(jì)分(I)：3分為強(qiáng)著色；2分為中等著色；1分為淺著色。最終的結(jié)果為組織學(xué)積分(H)=P+I。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜組織中的表達(dá)定位

本研究通過(guò)用免疫組化實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)AQP-8、Caspase7蛋白在兩組產(chǎn)婦胎膜組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示AQP-8、Caspase7蛋白在兩組產(chǎn)婦的胎盤(pán)和胎膜組織的細(xì)胞中均有陽(yáng)性表達(dá)，呈棕黃色，其陽(yáng)性表達(dá)部位主要分布于胎膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿中。AQP-8蛋白在羊水過(guò)少患者胎膜組織中表達(dá)呈弱陽(yáng)性，同時(shí)在正常孕產(chǎn)婦的細(xì)胞中呈中度陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖1、圖2；Caspase7在羊水過(guò)少患者胎膜上皮細(xì)胞中呈中度陽(yáng)性表達(dá)，而在正常孕產(chǎn)婦的細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)圖3、圖4。

圖1 羊水過(guò)少患者胎膜中AQP-8的表達(dá)

Fig.1 The expression of AQP-8 in membranes of patientswith oligohydramnio

圖2 正常產(chǎn)婦胎膜中AQP-8的表達(dá)

Fig.2 The expression of AQP-8 in membranes of normalpuerpera

圖3 羊水過(guò)少患者胎膜中Caspase7的表達(dá)

Fig.3 The expression of Caspase7 in membranes of patients with oligohydramnios

圖4 正常產(chǎn)婦胎膜中Caspase7的表達(dá)

Fig.4 The expression of Caspase7 in membranes of normal puerpera

2.2 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜組織中的表達(dá)比較

AQP-8和Caspase7在兩組孕產(chǎn)婦胎膜組織中陽(yáng)性表達(dá)部位主要分布于胎膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞漿中。經(jīng)兩樣本比較的t檢驗(yàn)分析得出：實(shí)驗(yàn)組的AQP-8蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組孕產(chǎn)婦胎膜細(xì)胞中的Caspase7表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)附表。因此可以認(rèn)為孕產(chǎn)婦發(fā)生羊水過(guò)少與胎膜細(xì)胞中AQP-8的低表達(dá)及Caspase7的高表達(dá)有關(guān)。

Table Comparison of histologic integral of AQP-8 and Caspase7 expression in membranes

2.3 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜組織中的表達(dá)關(guān)系

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組孕產(chǎn)婦胎膜上皮細(xì)胞中AQP-8與Caspase7表達(dá)的相關(guān)系數(shù)rs=0.14，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在實(shí)驗(yàn)組rs=-0.66，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示正常對(duì)照組孕產(chǎn)婦胎膜上皮細(xì)胞中AQP-8與Caspase7的表達(dá)并無(wú)相關(guān)性關(guān)系，而在實(shí)驗(yàn)組胎膜細(xì)胞中AQP-8與Caspase7的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

3.1 水通道蛋白與凋亡因子

AQP從結(jié)構(gòu)上而言是一種膜整合蛋白，可介導(dǎo)小分子物質(zhì)快速被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。除轉(zhuǎn)運(yùn)水分子外，AQP-8還被發(fā)現(xiàn)可以轉(zhuǎn)運(yùn)嘌呤、嘧啶、多元醇等小分子物質(zhì)，因此推測(cè)AQP-8參與了水和其它溶質(zhì)由母體向胎兒的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，決定羊水的膜內(nèi)吸收途徑。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤細(xì)胞中如肺癌、白血病細(xì)胞等也存在AQP-8[4-5]。缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)增加后會(huì)使AQP的表達(dá)上調(diào)[6]。自Afire等在1988年發(fā)現(xiàn)AQP后，目前已在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了13種AQP，它們統(tǒng)稱為AQP家族(AQPs)。它們保持人體細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)也參與機(jī)體部分重要的生理功能。

Caspase家族在細(xì)胞凋亡程序中起著關(guān)鍵性作用。細(xì)胞凋亡普遍存在于自然界，對(duì)于維持人體的穩(wěn)定性和保證人體的正常發(fā)育均具有重要的意義。一旦體內(nèi)的凋亡機(jī)制發(fā)生異常將引起多種疾病的發(fā)生。Caspase7即為半胱氨酸蛋白酶-7，是由303個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量約為35kd。作為Caspases家族中最重要的成員之一，Caspase7是細(xì)胞凋亡共同通路的效應(yīng)分子，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在正常情況下，Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑有3種，但無(wú)論哪條通途，最終都匯合于效應(yīng)Caspase(包括Caspase3、Caspase7)。Caspase7在細(xì)胞內(nèi)通常以無(wú)活性的酶原形式存在，一旦被激活就啟動(dòng)凋亡程序，并以級(jí)聯(lián)放大方式傳導(dǎo)和放大凋亡信號(hào)，向下游凋亡執(zhí)行因子傳遞，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。同時(shí)，Caspases之間還能相互激活，活化后的Caspase能特異性的識(shí)別底物，具有高度的特異性，保證了其在細(xì)胞凋亡程序中的專一性。胰島素樣生長(zhǎng)因子可調(diào)控Cyt-C釋放入胞質(zhì)，從而抑制Caspase3引發(fā)的細(xì)胞凋亡[7-13]。

3.2 水通道蛋白、凋亡因子與羊水過(guò)少

孕婦胎盤(pán)胎膜上AQPs的表達(dá)及其與妊娠相關(guān)疾病關(guān)系的研究始于2000年，目前在孕婦胎盤(pán)或胎膜上僅發(fā)現(xiàn)有AQP-1、AQP-3、AQP-8和AQP-9的表達(dá)，暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)其他AQP。為了解AQPs與羊水平衡的關(guān)系，Mann等(2006年)將AQP1基因敲除小鼠與正常小鼠相比，羊水量明顯增加，故推測(cè)胎膜上的AQP1缺陷可能是導(dǎo)致原發(fā)性羊水過(guò)多發(fā)生的病因。同時(shí)，Zhu等[14]在研究原發(fā)性羊水過(guò)多的病因時(shí)，發(fā)現(xiàn)其羊膜上皮細(xì)胞、絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞中的AQP-8表達(dá)較正常組有明顯的升高。劉慧妹等[15]也運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)了5例羊水過(guò)多胎膜組織中AQP-1、-3、-8、-9 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)羊水過(guò)多組孕婦胎膜中AQP-8 mRNA表達(dá)顯著高于正常組。熊正方等[16]研究了5例正常和羊水過(guò)少孕婦的胎盤(pán)上AQP-1、-3、-8、-9 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示羊水過(guò)少組的胎盤(pán)組織中僅有AQP-8 mRNA表達(dá)顯著低于正常組孕婦，這與Mann等的研究結(jié)果不一致。Yasui等(1997年)提出，對(duì)于AQPs調(diào)節(jié)羊水量的機(jī)制不僅與羊水的吸收有關(guān)，可能也與羊水的生成如胎肺分泌物有關(guān)。究竟AQPs是羊水量異常的病因，還是羊水量異常發(fā)生時(shí)的代償機(jī)制，仍有待于進(jìn)一步的研究。

正常孕婦的胎膜細(xì)胞在胎盤(pán)胎膜發(fā)育全過(guò)程中進(jìn)行有序的細(xì)胞凋亡。Caspase7在正常妊娠胎膜絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的正常表達(dá)可以確保正常胎膜細(xì)胞的凋亡，維持著母胎之間的物質(zhì)交換及胎兒的正常發(fā)育。當(dāng)Caspase7的表達(dá)異常時(shí)可誘發(fā)細(xì)胞凋亡程序發(fā)生障礙，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡增加后，其細(xì)胞體積縮小，從而導(dǎo)致大多數(shù)滋養(yǎng)細(xì)胞表面的AQP失活，不再介導(dǎo)水分子的跨膜運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞對(duì)羊水的通透性下降，從而導(dǎo)致妊娠羊水過(guò)少的發(fā)生。因此，如果Caspase的表達(dá)異常是引起羊水過(guò)少的發(fā)病機(jī)制，那Caspase可作為一種新的治療羊水過(guò)少的手段。

本研究發(fā)現(xiàn)，在光鏡下AQP-8和Caspase7蛋白在兩組產(chǎn)婦胎膜細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，在陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中均可見(jiàn)明顯的棕黃色染色陽(yáng)性顆粒。與正常對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組胎膜細(xì)胞中AQP-8蛋白的表達(dá)明顯降低；而Caspase7的表達(dá)以中度及強(qiáng)陽(yáng)性為主，升高明顯，差異均有顯著性(均P<0.05)。由此推測(cè)，在實(shí)驗(yàn)組孕婦胎膜細(xì)胞上Caspase7的表達(dá)影響AQP的結(jié)構(gòu)和功能，會(huì)使AQP-8的表達(dá)下降，從而改變細(xì)胞對(duì)羊水的通透性，減少羊水膜內(nèi)途徑的重吸收，阻止過(guò)多的液體重吸收進(jìn)入胎兒血循環(huán)，達(dá)到平衡羊水量的目的。

3.3 展望

本研究表明AQP-8及Caspase7蛋白在羊水過(guò)少孕婦的胎膜組織中表達(dá)異常，為母胎液體交換及羊水平衡的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)，同時(shí)，為羊水過(guò)少的臨床診斷及治療提供了新的思路，進(jìn)而改善臨床最后的結(jié)局，最終降低剖宮產(chǎn)率、圍生兒病率和死亡率，提高了圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)質(zhì)量。但是，AQP-8及Caspase7蛋白調(diào)節(jié)胎膜羊水量平衡的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，以后期望通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多因素分析研究，來(lái)尋找羊水過(guò)少發(fā)生的生物學(xué)特性，進(jìn)一步揭示其發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律，為羊水過(guò)少的早預(yù)防、早診斷和早治療提供新的思路。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：楊文方]

Expression of AQP-8 and Caspase7 in membranes of pregnant women with oligohydramnios

LI Xiao-qin, XIE Yan-fei

(DepartmentofObstetrics,Yan’anUniversityAffiliatedHospital,ShaanxiYan’an716000,China)

Objective To explore the difference in expressions of aquaporin 8 (AQP-8) and Caspase7 in membranes of puerpera with oligohydramnios and of normal puerpera. Methods Immunohistochemistry was performed to determine the expressions of AQP-8 and Caspase7 in membranes of experimental group (n=30, puerpera with oligohydramnios) and of control group (n=30, normal pregnant women), and the expression strength was analyzed. Results The expressions of AQP-8 and Caspase7 in membranes of two groups were positive. Compared with the control group, the expression of AQP-8 was lower and that of Caspase7 was higher in the experimental group, and the differences were significant (tvalue was 4.56 and 2.60, respectively, bothP<0.05). The expression of AQP-8 was negatively correlated with that of Caspase7 in the experimental group (r=-0.66,P<0.05).Conclusion The abnormal expression of AQP-8 and Caspase7 in membranes of puerpera may be one of the causes of oligohydramnios.

oligohydramnios；membranes；aquaporin(AQP)；Caspase7；immunohistochemistry

2014-11-03

李小琴(1973-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事產(chǎn)科臨床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.017

R714.25

A

1673-5293(2015)03-0450-03