黃燕萍，王 祥，高 娜，趙文靜，孫 艷，馬丹萍，劉 麗

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安710061；2.萊州市人民醫(yī)院兒科，山東 萊州261400；3.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安710068；4.西安市中心醫(yī)院，陜西 西安710003)

大蒜素對IgA腎病纖維化大鼠腎臟保護作用的研究

黃燕萍1，王 祥2，高 娜3，趙文靜4，孫 艷4，馬丹萍1，劉 麗1

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安710061；2.萊州市人民醫(yī)院兒科，山東 萊州261400；3.陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安710068；4.西安市中心醫(yī)院，陜西 西安710003)

目的 研究大蒜素對IgA腎病腎間質纖維化的影響，并探討其可能的腎臟保護機制。方法 聯(lián)合IgA腎病模型及單側輸尿管結扎的方法建立IgA腎病纖維化的動物模型。將SD大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組及高、低劑量大蒜素治療組，按各組相應藥物劑量灌胃。于干預前、干預14天及28天檢測各組大鼠尿紅細胞計數(shù)、尿素氮水平及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)含量；并于28天末光鏡下觀察各組大鼠腎臟的病理改變。結果 與模型對照組相比，高、低劑量大蒜素治療組大鼠尿紅細胞計數(shù)(模型組-高劑量組，干預14天/28天，t=1.12/5.58；模型組-低劑量組，干預14天/28天，t=1.62/7.51)、尿素氮水平、血清TNF-α(模型組-高劑量組，干預14天/28天，t=3.48/11.95；模型組-低劑量組，干預14天/28天，t=4.76/12.78)、α-SMA含量(模型組-低劑量組，干預14天/28天，t=5.38/5.77)均降低(均P<0.05)，腎小球系膜區(qū)IgA沉積強度明顯減輕，腎組織病理纖維化程度亦有所減輕。大蒜素高、低劑量治療組在降低尿紅細胞計數(shù)(干預28天，t=1.99)、血清TNF-α(干預28天，t=3.73)和α-SMA(干預14天/28天，t=5.60/4.81)水平上差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，以大蒜素低劑量效果稍好。結論 血清TNF-α和α-SMA在IgA腎病纖維化進展中進行性增高；大蒜素能夠改善IgA腎病纖維化大鼠的臨床癥狀、減輕腎臟病理學損害，可能通過降低血清TNF-α和α-SMA水平發(fā)揮抗腎臟纖維化的作用。

IgA腎病；腎間質纖維化；腫瘤壞死因子-α；α-平滑肌肌動蛋白

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是常見的原發(fā)性腎小球疾病之一，其病理特點是腎小球系膜區(qū)以IgA為主的免疫復合物沉積，常合并有系膜細胞增生、基質增多的組織學改變。以往認為兒童期發(fā)病者預后良好，但近年研究發(fā)現(xiàn)在確診后的5～25年內，約9%～50%的患者呈進行性發(fā)展，不可逆轉地進展為終末期腎病，而腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是其主要病理學特征。

IgA腎病RIF的發(fā)生機制十分復雜，其中，多種細胞因子在腎纖維化中的相互作用越來越得到學者們的關注。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)既往作為炎癥因子被廣泛研究，目前發(fā)現(xiàn)TNF-α能影響多種正常細胞的生長及分化，并刺激成纖維細胞的增殖，在組織纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。α-平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)是真核細胞的一種細胞骨架蛋白，也是肌成纖維細胞的標志性蛋白。Badid等[1]諸多學者認為α-SMA可能是預測腎臟纖維化進展的理想指標。本實驗旨在建立IgA腎病纖維化大鼠模型，以TNF-α及α-SMA為實驗指標，研究大蒜素對IgA腎病RIF的影響，并探討其可能的抗腎臟纖維化作用。

1 實驗材料和方法

1.1 動物的選擇

健康、雌性、清潔級SD大鼠32只，鼠齡為6周左右，體重在160～180g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥品與試劑的選擇

大蒜素膠囊(20mg/粒，批號：120607)、牛血清白蛋白(美國Amresco公司)、脂多糖(美國Sigma公司)、正常山羊血清(武漢博士德生物工程有限公司)、兔抗大鼠IgA抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標記山羊抗兔IgG抗體、TNF-α及α-SMA ELISA試劑盒(96T/盒，北京博奧森生物技術有限公司，批號：120829)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模

聯(lián)合IgA腎病模型及單側輸尿管結扎的方法建立IgA腎病纖維化的動物模型。牛血清白蛋白(400mg/kg)自實驗第1天起，隔日灌胃，持續(xù)9周；四氯化碳(0.1mL/只)自實驗第1周末起，皮下注射，每周1次，持續(xù)9周；脂多糖(0.05mg/只)于實驗第6、8周末，尾靜脈注射。9周末用5%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，沿左側腹切口(1～2cm)暴露分離左側輸尿管，結扎并剪斷輸尿管近腎盂段，縫合切口。術后常規(guī)予青霉素抗感染治療3天。

1.3.2 實驗分組及用藥

隨機選8只作為正常對照組，剩余大鼠進行IgA腎病纖維化造模。建模成功后再隨機分為模型對照組、高劑量大蒜素治療組及低劑量大蒜素治療組，每組8只。其中，正常對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃；高、低劑量大蒜素治療組分別給予大蒜素膠囊溶液(60mg/kg)和大蒜素膠囊溶液(40mg/kg)灌胃，每日1次，持續(xù)28天。

1.3.3 標本收集

分別于干預前、干預14天及干預28天觀察大鼠的一般情況，收集大鼠尿液、血液以檢測尿紅細胞計數(shù)、尿素氮水平、血清TNF-α及α-SMA含量。干預28天末處死大鼠，取腎組織分別做普通光鏡蘇木精-伊紅(HE)染色、三色膠原(Masson)染色及免疫熒光檢查。采用間接免疫熒光法按照國內通用標準進行分級(5級)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 實驗大鼠的一般情況

正常對照組大鼠一般情況良好，無明顯改變。模型對照組及高、低劑量大蒜素治療組大鼠在造模期間出現(xiàn)毛發(fā)蓬亂、活動量減少、精神萎靡等狀況，大蒜素干預后兩治療組大鼠上述癥狀較前好轉。干預期間，模型對照組及高劑量大蒜素治療組各死亡大鼠1只，可能與術后切口感染及眼底靜脈叢采血不當有關。

2.2 血清腫瘤壞死因子-α及α-平滑肌肌動蛋白的變化情況

與正常對照組相比，干預前、干預14天、干預28天，模型對照組及高、低劑量大蒜素治療組大鼠血清TNF-α及α-SMA均明顯升高(均P<0.05)。

①TNF-α：與模型對照組相比，干預14天及28天時，高、低劑量大蒜素治療組大鼠血清TNF-α均明顯降低，高、低劑量大蒜素治療組均有顯著性差異(均P<0.05)；干預28天時，高、低劑量大蒜素治療組組間比較有顯著性差異(P<0.05)，低劑量大蒜素治療組降低血清TNF-α效果更明顯(P<0.05)，見表1。

②α-SMA：與模型對照組相比，干預14天及28天時，高、低劑量大蒜素治療組大鼠血清α-SMA均明顯降低，低劑量大蒜素治療組均有顯著性差異(均P<0.05)，高、低劑量大蒜素治療組組間比較亦有顯著性差異(P<0.05)，低劑量大蒜素治療組降低血清TNF-α效果更明顯(P<0.05)，見表2。

2.3 臨床指標變化情況

與正常對照組相比，模型對照組和高、低劑量大蒜素治療組大鼠尿紅細胞計數(shù)、尿素氮均明顯升高(均P<0.05)。

①尿紅細胞計數(shù)：與模型對照組相比，干預14天及28天時，高、低劑量大蒜素治療組大鼠尿紅細胞計數(shù)均明顯降低，高、低劑量大蒜素治療組均有顯著性差異(均P<0.05)；干預28天時，高、低劑量大蒜素治療組組間比較有顯著性差異(P<0.05)，低劑量大蒜素治療組降低尿紅細胞計數(shù)效果更明顯(P<0.05)，見表3。

組別例數(shù)(n)干預前t干預14天t干預28天t正常對照組813.18±3.59 13.57±3.74 13.35±2.65 模型對照組720.40±2.78★2.7447.33±4.43★14.1366.18±2.90★ 47.50高劑量大蒜素治療組719.53.±3.41★2.2339.78±2.90★■16.06/3.4847.49±2.63★■26.43/11.95低劑量大蒜素治療組821.76±1.92★3.6534.14±3.73★■11.02/4.7640.48±3.71★■◆15.12/12.78/3.73F11.7394.93354.64P0.000.000.00

注：★表示與正常對照組比較P<0.05，■表示與模型對照組比較P<0.05，◆表示與高劑量大蒜素治療組比較P<0.05。

表2 血清α-SMA水平變化情況

注：★表示與正常對照組比較P<0.05，■表示與模型對照組比較P<0.05，◆表示與高劑量大蒜素治療組比較P<0.05。

②尿素氮：與模型對照組相比，干預14天及28天時，高、低劑量大蒜素治療組大鼠尿素氮均降低，高、低劑量大蒜素治療組均無顯著性差異(均P>0.05)，高、低劑量大蒜素治療組組間比較亦無顯著性差異(P>0.05)，見表4。

表3 尿紅細胞計數(shù)變化對照情況

注：★表示與正常對照組比較P<0.05，■表示與模型對照組比較P<0.05，◆表示與高劑量大蒜素治療組比較P<0.05。

表4 尿素氮變化對照情況

注：★表示與正常對照組比較P<0.05。

2.4 腎組織病理學改變情況

2.4.1 蘇木精-伊紅染色

正常對照組大鼠腎小球、腎小管大小形態(tài)正常；模型對照組大鼠腎小球腫脹明顯，彌漫性系膜細胞及基質增生。腎小管萎縮、壞死明顯，可見大量炎癥細胞浸潤；高、低劑量大蒜素治療組改變類似，但與模型對照組相比，腎小球系膜細胞及基質增生有所緩解，腎小管萎縮塌陷及間質炎性細胞浸潤程度有所減輕。

2.4.2 三色膠原染色

正常對照組大鼠腎間質染色較少；模型對照組大鼠腎小管結構破壞明顯，間質染色明顯增多，有大量膠原形成；高、低劑量大蒜素治療組改變類似，但與模型對照組相比，藍色面積染色減少，RIF的程度有所減輕，見圖1。

圖1 干預28天各組大鼠腎組織HE染色(左圖)與Masson染色(右圖)

Fig.1 Kidney tissues staining by HE(left) and Masson(right) at 28 days after intervention

2.4.3 腎組織IgA免疫熒光改變

正常對照組大鼠腎小球系膜區(qū)未見IgA沉積；模型對照組大鼠腎小球系膜區(qū)可見黃綠色團塊狀及顆粒狀的IgA沉積，熒光較強；高、低劑量大蒜素治療組大鼠系膜區(qū)亦有不同程度的IgA沉積，但熒光強度較弱，與模型對照組相比差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但組間比較未見顯著性差異(P>0.05)，見圖2、表5。

圖2 干預28天各組大鼠IgA沉積情況

Fig.2 IgA deposits of different groups at 28 days after intervention

表5 干預28天各組大鼠IgA免疫熒光定量

Table 5 IgA immunofluorescence quantitative of different groups at 28 days after intervention

2.5 實驗大鼠各指標間的相關性

血清TNF-α、α-SMA與尿紅細胞計數(shù)、尿素氮的相關性：①干預14天及28天，各組大鼠血清TNF-α與尿紅細胞計數(shù)之間有顯著正相關(均P<0.05)，相關系數(shù)rs分別為0.66、0.88；回歸方程分別為Y=11.13X-89.07、Y=8.94X-69.31，其中，X為血清TNF-α，Y是尿紅細胞計數(shù)；②干預14天及28天，各組大鼠血清TNF-α與血尿素氮之間有顯著正相關(均P<0.05)，相關系數(shù)rs分別為0.73、0.63；回歸方程分別為Y=0.18X+2.93、Y=0.10X+3.42，其中，X為血清TNF-α，Y是血尿素氮；③干預14天及28天，各組大鼠血清α-SMA與尿紅細胞計數(shù)之間有顯著正相關(均P<0.05)，相關系數(shù)rs分別為0.61、0.85；回歸方程分別為Y=6.20X-433.93、Y=5.78X-398.77，其中，X為血清α-SMA，Y是尿紅細胞計數(shù)；④干預14天及28天，各組大鼠血清α-SMA與血尿素氮之間有顯著正相關(均P<0.05)，相關系數(shù)rs分別為0.56、0.61；回歸方程分別為Y=0.10X-2.09、Y=0.07X-0.71，其中，X為血清α-SMA，Y是血尿素氮。

血清α-SMA與TNF-α的相關性：干預14及28天，各組大鼠血清α-SMA與TNF-α之間有顯著正相關(均P<0.05)，相關系數(shù)rs分別為0.71、0.86；回歸方程分別為Y=0.50X-24.62、Y=0.60X-31.29，其中，X為血清α-SMA，Y是血清TNF-α。

3 討論

3.1 IgA腎病纖維化大鼠模型的建立

湯穎等[2]運用隔日口服牛血清白蛋白、皮下注射四氯化碳及靜脈注射脂多糖的方法，建立了病理類型及臨床指標均與人類IgAN頗為相似的動物模型。國內已經有學者成功地應用IgA腎病模型聯(lián)合高脂飲食建立起IgA腎病血管病變的動物模型[3]以及應用IgA腎病模型聯(lián)合單側腎臟切除的方法建立起IgA腎病腎小球硬化模型[4]。本實驗模型對照組大鼠均出現(xiàn)明顯的血尿，伴尿素氮升高。大鼠腎臟病理學染色提示彌漫性系膜細胞及基質增生，腎小管萎縮、壞死明顯，間質纖維化顯著，可見大量炎癥細胞浸潤。免疫熒光下腎小球系膜區(qū)可見黃綠色IgA沉積，提示IgA腎病纖維化的大鼠模型建立成功。

3.2 大蒜素對IgA腎病纖維化大鼠腎臟保護作用

細胞因子調控失衡是腎組織纖維化的形成和發(fā)展的重要原因之一。TNF-α是一種由多種細胞產生的具有廣泛生物學活性的細胞毒細胞因子，近年來發(fā)現(xiàn)TNF-α亦可刺激成纖維細胞增殖，對正常細胞的生長及分化有一定的調節(jié)作用，提示TNF-α可能是一種潛在的致纖維化因子。羅小良等[5]在研究大蒜素對脂多糖誘導人牙周膜成纖維細胞凋亡實驗中發(fā)現(xiàn)，大蒜素能抑制牙周膜成纖維細胞TNF-α的分泌，進而促進成纖維細胞的凋亡。核因子-κB(NF-κB)是調節(jié)細胞基因轉錄的關鍵因子之一，多項研究顯示TNF-α可激活NF-κB途徑而介導多種炎癥介質的轉錄與表達。張鵬等[6]在研究大蒜素對膿毒癥大鼠腦保護作用的研究中發(fā)現(xiàn)，大蒜素能降低膿毒癥大鼠腦組織中NF-κB值，進而降低膿毒癥大鼠的血糖、谷丙(草)轉氨酶及血尿素氮值，其可能的保護機制是否通過下調TNF-α水平而抑制NF-κB在腎組織的表達，有待后續(xù)的進一步研究。

曾玉蘭等[7]在研究大蒜素對博萊霉素復制大鼠肝纖維化的實驗中發(fā)現(xiàn)，大蒜素能降低肺組織內羥脯氨酸的濃度，其可能的保護作用與下調轉化生長因子-β1(TGF-β1)的表達，從而減少成纖維細胞α-SMA基因的表達有關。董正華等[8]在研究糖尿病腎病大鼠模型時發(fā)現(xiàn)，中藥治療組大鼠血清TNF-α水平及腎小管上皮細胞α-SMA表達均明顯降低，提示降低TNF-α水平可能會延緩腎小管上皮細胞向肌成纖維細胞的轉化。本實驗結果顯示模型對照組大鼠血清TNF-α、α-SMA水平明顯增高，而大蒜素能夠顯著降低上述指標含量，提示大蒜素延緩RIF的作用可能與降低上述兩者的水平而抑制細胞外基質沉積或者抑制腎小管上皮轉分化有關。

α-SMA是肌成纖維細胞(MF)的標志性蛋白，轉化后的MF既能大量合成間質膠原，又具有強大的收縮能力，引起腎臟結構的重塑，共同促進腎臟纖維化的發(fā)生。有研究提示組織中α-SMA的檢測有助于了解腎小球或腎小管間質的病損程度，對慢性腎病的長期預后有一定的預測意義[9]。既往關于α-SMA的研究僅涉及腎臟組織中的表達，而腎臟穿刺作為一種有創(chuàng)檢查，血清中α-SMA的測定更加凸顯出意義。本實驗結果顯示模型對照組大鼠血清α-SMA在IgA腎病纖維化進展中進行性增高，且與尿紅細胞計數(shù)、尿素氮及TNF-α均呈正線性相關，提示血清α-SMA測定可能是一種理想的替代物，可作為一種新的纖維化指標有助于IgA腎病RIF的診斷。

IgA腎病RIF是一個極其復雜的病理過程，是在多種致病因子作用下，多種效應細胞、細胞因子等共同作用的結果。本實驗只檢測了血清中TNF-α和α-SMA的含量，且關于血清中α-SMA的來源及去路不甚清楚，因此大蒜素抗RIF的作用機制有待進一步研究。

[1]Badid C, Mounier N, Costa A M,etal.Role of myofibroblasts during normal tissue repair and excessive scarring:Interest of their assessment in nephropathies[J].Histol Histopathol,2000,15(1):269-280.

[2]湯穎,婁探奇,成彩聯(lián),等.實驗性IgA腎病模型的改進[J].中山大學學報,2006,27(2):184-187.

[3]邵健娜,張建榮.來氟米特對IgA腎病大鼠血管病變的保護作用[D].新鄉(xiāng):新鄉(xiāng)醫(yī)學院碩士學位論文,2012.

[4]黃國東,許健,姜云,等.復方仙草顆粒對IgA腎病腎小球硬化大鼠TGF-β/Smads信號通路的影響[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(11):2822-2824.

[5]羅小良,謝曉莉.大蒜素對脂多糖誘導人牙周膜成纖維細胞凋亡及IL-1β、TNF-α分泌的影響[D].長沙:中南大學碩士學位論文,2010.

[6]張鵬,曹農.大蒜素對膿毒癥大鼠腦保護機制的探討[D].蘭州:蘭州大學碩士學位論文,2014.

[7]曾玉蘭,冷凡.大蒜素對肺纖維化大鼠肺組織α-SMA和TGF-β1表達的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2011,21(15):1814-1818.

[8]董正華,趙曉睿,馬拯華,等.通絡益腎滋陰方對糖尿病腎病大鼠血清TNF-α及腎小管上皮細胞α-SMA的影響[J].現(xiàn)代中醫(yī)藥,2009,29(2):58-61.

[9]周瑤,楊林.CKD患者腎組織α-SMA的表達與頸動脈內膜厚度的關系[D].石家莊:河北醫(yī)科大學碩士學位論文,2014.

[專業(yè)責任編輯：古桂雄]

Protection function of tumor necrosis factor-α and α-smooth muscle actin in IgA nephropathy fibrosis

HUANG Yan-ping1, WANG Xiang2, GAO Na3, ZHAO Wen-jing4, SUN Yan4, MA Dan-ping1, LIU Li1

(1.DepartmentofPediatrics,TheFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China; 2.DepartmentofPediatrics,LaizhouCityPeople’sHospital,ShandongLaizhou261400,China;3.ShaanxiProvincialPeople’sHospital,ShaanxiXi’an710068,China; 4.CentralHospitalofXi’an,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To study the influence of diallyl trisulfide on IgA nephropathy renal interstitial fibrosis and to explore its possible renal protective mechanism. Methods IgA nephropathy fibrotic model in rats were established in study by combining IgA nephropathy model with unilateral ureteral obstruction. The healthy SD rats were randomly and equally divided into 4 groups: normal control group, model control group, high-dose dially trisulfide (DATS) treatment group and low-dose DATS treatment group. The above groups were lavaged with corresponding drug. The urine and blood of rats were examined for urinary red blood cell count, blood urea nitrogen, TNF-α and α-SMA before intervention, 14 and 28 days after intervention. At the 28th day, all rats were sacrificed and their pathomorphological changes in kidneys were observed by immune fluorescence microscope. Results Compared with model control group, the levels of urine erythrocyte (model control group —high-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=1.12/5.58; model control group— low-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=1.62/7.51), blood urea nitrogen, TNF-α (model control group—high-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=3.48/11.95; model control group —low-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=4.76/12.78) and α-SMA (model control group—low-dose DATS treatment group, at 14/28 days after intervention,t=5.38/5.77) reduced in both DATS treatment groups. The degree of IgA deposits at glomerular mesangial area and the renal pathological fibrosis relieved in both DATS treatment groups. There were significant differences between high-dose and low-dose DATS treatment groups in reducing the levels of urine erythrocyte (at 28 days after intervention,t=1.99), TNF-α (at 28 days after intervention,t=3.73) and α-SMA (at 14/28 days after intervention,t=5.60/4.81) (allP<0.05). The effect of low-dose DATS treatment was more obvious.Conclusion The levels of TNF-α and α-SMA increase progressively in IgA nephropathy fibrosis developing. The dially trisulfide can relieve the clinical symptoms and pathological damages in IgA nephropathy fibrotic rats, and can prevent the occurrence of renal interstitial fibrosis by reducing the levels of serum TNF-α and α-SMA.

IgA nephropathy (IgAN)；renal interstitial fibrosis (RIF)；tumor necrosis factor-α (TNF-α)；alpha smooth muscle actin (α-SMA)

2014-07-11

黃燕萍(1963-)，女，教授，博士，主要從事小兒腎病的臨床與基礎研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.007

R392

A

1673-5293(2015)03-0418-05