步 軍，孫建華，吳圣楣

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心新生兒科，上海200127；2.貝因美母乳研究中心，上海200127)

上海部分地區(qū)母乳核苷特征的初步研究

步 軍1，孫建華1，吳圣楣2

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心新生兒科，上海200127；2.貝因美母乳研究中心，上海200127)

目的 通過(guò)檢測(cè)上海部分地區(qū)婦女母乳中所含潛在可利用核苷的組成和含量，初步探究中國(guó)人群母乳核苷酸的特征。方法 從來(lái)自上海部分地區(qū)的56名健康哺乳期婦女志愿者中采集母乳樣本71份，其中初乳(分娩后3～7天采集)39份，成熟乳(分娩后1～2個(gè)月采集)32份。全部母乳樣本經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酶解處理，將所含的各種核苷酸物質(zhì)分解為最終代謝產(chǎn)物核苷，再應(yīng)用高效液相色譜儀逐一檢測(cè)每個(gè)母乳樣本中5種核苷濃度，最后相加計(jì)算得到母乳中總潛在可利用核苷的含量。結(jié)果 在全部母乳樣本中均檢測(cè)出胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥(niǎo)嘌呤核苷和腺嘌呤核苷，其濃度中位數(shù)分別為100mol/L、47mol/L、15mol/L、21mol/L；因?yàn)樵诓坏桨霐?shù)的樣本(32/71)中檢測(cè)到低濃度的次黃嘌呤核苷，故將前4種母乳核苷成分之和作為總潛在可利用核苷，其濃度中位數(shù)為193mol/L。初乳和成熟乳中的尿嘧啶核苷和鳥(niǎo)嘌呤核苷濃度存在差異(Z值分別為-2.64、-2.13，均P<0.05)，初乳的總潛在可利用核苷含量高于成熟乳(Z=-2.09，P<0.05)。結(jié)論 上海地區(qū)母乳總潛在可利用核苷的平均水平和核苷組成與歐美以及亞洲其他地區(qū)人群中應(yīng)用相同方法檢測(cè)所得結(jié)果類(lèi)似，以胞嘧啶核苷濃度最高，而次黃嘌呤核苷僅在部分樣本中存在。

母乳；初乳；核苷酸；核苷

母乳是國(guó)際公認(rèn)的喂養(yǎng)嬰兒“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，嬰兒奶粉的配方通常要求盡可能接近母乳。由于反芻動(dòng)物乳中的核苷酸含量明顯低于人乳，主要以牛乳為原料的嬰兒配方乳需要進(jìn)行核苷酸強(qiáng)化，針對(duì)母乳核苷酸特征的研究是母乳營(yíng)養(yǎng)研究的重要組成部分。自從上世紀(jì)60年代早期首次從人類(lèi)母乳中分離出核苷酸后，有關(guān)母乳核苷酸特征的研究報(bào)道逐漸增多，但是由于檢測(cè)方法不同，導(dǎo)致不同的研究結(jié)果差異很大。1995年Leach等建立了一種新的方法，以“總潛在可利用核苷”(total potential available nucleoside，TPAN)來(lái)全面評(píng)價(jià)母乳中可被嬰兒消化吸收的核苷類(lèi)物質(zhì)，應(yīng)用此方法檢測(cè)所得歐美人群母乳T(mén)PAN平均水平被作為核苷酸的推薦添加量，在部分嬰兒奶粉配方中應(yīng)用至今。但是迄今為止，國(guó)內(nèi)僅有部分研究報(bào)道了嬰幼兒配方食品如奶粉的核苷酸定量檢測(cè)方法[1-2]，尚無(wú)針對(duì)中國(guó)人群母乳核苷酸成份和含量特征的研究報(bào)道。本研究擬對(duì)上海部分地區(qū)哺乳婦女母乳中的TPAN水平進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)母乳所含核苷的特點(diǎn)和影響因素進(jìn)行初步了解，為進(jìn)一步深入研究中國(guó)人群母乳核苷酸的總體特征打下基礎(chǔ)。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

自2013年2至10月在上海市浦東新區(qū)和崇明縣根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)募集母乳捐贈(zèng)者，經(jīng)過(guò)知情同意后成為研究對(duì)象，按標(biāo)準(zhǔn)流程采集母乳，并填寫(xiě)乳母基礎(chǔ)資料。研究方案經(jīng)過(guò)上海兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

入選標(biāo)準(zhǔn)：既往身體健康、營(yíng)養(yǎng)良好的足月分娩產(chǎn)婦，年齡在22～40歲之間，無(wú)嚴(yán)重妊娠合并癥和感染性疾病史，完全或主要以母乳喂養(yǎng)為主，哺乳期間無(wú)發(fā)熱等疾病和用藥史。所生新生嬰兒體健，無(wú)特殊疾病史。

本研究共募集研究對(duì)象56人，采集合格母乳樣本71份，包括初乳39份，成熟乳32份；其中15人采集初乳和成熟乳各1份，41人僅采集初乳或成熟乳1份。提供母乳樣本的哺乳期婦女年齡為23～34歲，孕齡37+5～41+3周；順產(chǎn)36人，剖宮產(chǎn)20人，其中初產(chǎn)42人；上海籍27人，非上海籍29人；新生兒出生體重為2 755～4 050g，其中純母乳喂養(yǎng)45人，混合喂養(yǎng)11人。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集

分別于分娩后3～7天和/或1～2個(gè)月采集研究對(duì)象母乳樣本，采集過(guò)程由專(zhuān)人負(fù)責(zé)操作。本研究以分娩后3～7天采集樣本作為初乳組，分娩后1～2個(gè)月采集樣本作為成熟乳組。

采集和儲(chǔ)存方法如下：采集前檢查乳房和乳頭無(wú)異常破損后用溫水洗凈，輕擠乳房使乳汁自然流出，觀(guān)察顏色性狀無(wú)異常后改用吸乳器吸引，直至基本吸空單側(cè)乳房，在10分鐘內(nèi)完成。檢查吸出乳汁無(wú)血液等異物混入后取10mL置于無(wú)菌冷凍離心管中，迅速放入-20℃以下冰箱暫存，之后轉(zhuǎn)送至-70℃深低溫冰箱長(zhǎng)期儲(chǔ)存?zhèn)錂z。

1.2.2 樣本處理

本研究采用Leach等1995年報(bào)道的方法檢測(cè)單個(gè)母乳樣本中的核苷濃度。儲(chǔ)存母乳在檢測(cè)前置于室溫自然融化后加入1mol/L的NaOH水溶液，密封后振蕩，用鹽酸調(diào)節(jié)混合液pH至中性，用蒸餾水稀釋至100mL，以5-甲基胞苷(sigma，M-6254)為內(nèi)標(biāo)，取9μg加入5mL稀釋液中，分別加入磷酸二酯酶P1(sigma，N-8630)19單位、焦磷酸酶(sigma，P-7383)0.4單位、堿性磷酸酶(sigma，P-4252)16單位進(jìn)行水解，振蕩反應(yīng)48小時(shí)，將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，并加入12.5mL磷酸氫二鉀溶液，定容至25mL，以0.22μm濾器過(guò)濾備用。

1.2.3 固相抽提

將裝備有150μL Affi-Gel 601凝膠(Bio-Rad，153-6101)的固相萃取柱用磷酸氫二鉀緩沖液(pH10.5)平衡3次，取待檢母乳樣品1mL過(guò)柱，用1mol/L磷酸溶液進(jìn)行洗脫，再用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.4 樣本檢測(cè)

本研究采用Agilent HP1100高效液相色譜質(zhì)譜儀(HPLC)進(jìn)行檢測(cè)分析，選擇SB-C18 5μm 150×2.1mm色譜柱為固定相，以乙酸鉀和己烷磺酸鈉(20:1)以及乙腈分別為流動(dòng)相，流速每分鐘0.2mL，柱溫24.5℃，核苷檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為255nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)計(jì)算

每種核苷的校準(zhǔn)曲線(xiàn)通過(guò)計(jì)算系列稀釋濃度的5種核苷標(biāo)準(zhǔn)品(sigma：U-3750；C-9505；I-4125；G-6752；A-9251)和固定濃度的內(nèi)標(biāo)5-甲基胞苷面積比值構(gòu)成。通過(guò)HPLC分析測(cè)得的各種核苷內(nèi)標(biāo)面積比值進(jìn)行計(jì)算得到該種核苷濃度，母乳中的各種核苷濃度之和即為母乳T(mén)PAN含量。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有檢測(cè)母乳樣本中各種核苷含量數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布，故以中位數(shù)、四分位間距(M，Q75-25)表示；初乳和成熟乳核苷含量的差異采用兩組獨(dú)立樣本的Mann-Whitney檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 母乳核苷類(lèi)物質(zhì)水平

在所有的母乳標(biāo)本中均檢測(cè)到除次黃嘌呤核苷(I)以外的4種核苷，而I僅在不到半數(shù)的樣本中(32/71)檢測(cè)到低濃度的含量，故未納入統(tǒng)計(jì)分析。母乳中的胞嘧啶核苷(C)濃度為(100，56) μmol/L；尿嘧啶核苷(U)濃度為(47，29)μ mol/L；鳥(niǎo)嘌呤核苷(G)濃度為(15，19) μmol/L；腺嘌呤核苷(A)濃度為(21，16) μmol/L；4種核苷濃度合計(jì)為T(mén)PAN濃度，經(jīng)過(guò)計(jì)算得出TPAN濃度為(193，74) μmol/L。

2.2 初乳和成熟乳核苷類(lèi)物質(zhì)水平的比較

初乳組與成熟乳組4種核苷和TPAN的濃度進(jìn)行比較，結(jié)果顯示兩組之間的TPAN濃度差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，初乳濃度高于成熟乳；4種核苷中U和G的濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)附表。

附表 初乳和成熟乳核苷濃度的比較結(jié)果[(M，Q75-25)，mmol/L]

Table Comparison of nucleosides concentration between colostrum and mature [(M，Q75-25)，mmol/L]

3 討論

3.1 母乳核苷酸的生理作用和成分特征

核苷酸(Nucleotides)及其相關(guān)代謝產(chǎn)物在許多生物學(xué)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，體內(nèi)核苷酸的來(lái)源既可為內(nèi)源性生化途徑，也可為外源性營(yíng)養(yǎng)途徑。由于外源性核苷類(lèi)物質(zhì)的供給對(duì)于維持人體部分組織器官的正常功能具有重要意義，因此核苷酸和其化合物被稱(chēng)為“條件”必需或半必需營(yíng)養(yǎng)素，尤其對(duì)處于快速生長(zhǎng)發(fā)育階段的新生嬰兒顯得更為重要。較早的研究已發(fā)現(xiàn)核苷酸對(duì)于嬰兒整體免疫和腸道局部免疫、營(yíng)養(yǎng)代謝、抗感染等多方面具有促進(jìn)作用[3-4]，近年以來(lái)還發(fā)現(xiàn)其對(duì)于嬰兒睡眠節(jié)律的形成有一定作用[5]，但是未證實(shí)嬰兒期核苷類(lèi)物質(zhì)的攝入和兒童早期過(guò)敏性疾病相關(guān)[6]。在膳食中進(jìn)行強(qiáng)化是補(bǔ)充嬰兒外源性核苷酸的主要途徑，但是添加的種類(lèi)和適宜量尚不明確，而母乳中的核苷酸譜和含量則成為主要的參考依據(jù)。

上世紀(jì)80年代起國(guó)外開(kāi)始應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)研究母乳所含核苷酸和核苷類(lèi)物質(zhì)，由于母乳中核苷類(lèi)物質(zhì)來(lái)源的多樣性和不穩(wěn)定性，母乳核苷類(lèi)物質(zhì)來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外，除了游離狀態(tài)的核苷酸和核苷以外，還包括了核苷酸加合物(如NAD和UDP糖)和主要為RNA的核苷酸聚合物等，同時(shí)母乳中所包含的生物活性酶對(duì)于核苷酸具有分解作用，因此不同的處理和評(píng)價(jià)方法導(dǎo)致不同的研究結(jié)果差異很大。雖然已有研究應(yīng)用反向高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和毛細(xì)管電泳法測(cè)定嬰兒配方乳中的核苷酸和核苷含量[7-8]，但是尚無(wú)應(yīng)用于母乳研究的報(bào)道。Leach等的檢測(cè)方法模擬核苷酸在人體消化道的吸收過(guò)程，首先通過(guò)酶解法將母乳所含包括游離核苷、游離核苷酸、核苷酸加合物(如NAD和UDP糖)和主要為RNA的核苷酸聚合物在內(nèi)的所有核苷物質(zhì)分解為單體核苷，再通過(guò)HPLC技術(shù)測(cè)定各種核苷含量，并將其總和稱(chēng)為T(mén)PAN。與以往的檢測(cè)指標(biāo)相比，TPAN是一個(gè)反映母乳中總體核苷酸含量的綜合指標(biāo)。Leach等檢測(cè)了采集自3個(gè)歐洲國(guó)家100個(gè)哺乳期婦女不同泌乳階段的母乳匯集而成的16個(gè)樣本池，其結(jié)果顯示所測(cè)母乳的TPAN含量為189±70mmol/L(范圍82～402μmol/L)，母乳中不同核苷含量差異大，平均含量以胞嘧啶核苷為最高，而次黃嘌呤核苷僅在一個(gè)樣本池中檢出。2003年Tressler等報(bào)道了亞洲婦女母乳中的TPAN含量，其從香港地區(qū)、菲律賓和新加坡的135名健康乳母中采集了160份4個(gè)不同階段的母乳，每10份樣本匯集成1個(gè)樣本池，應(yīng)用Leach等的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示TPAN的平均濃度為203μmol/L，其中初乳、過(guò)渡乳、早期和晚期成熟乳的平均濃度分別為171.9μmol/L、208.1μmol/L、221.6μmol/L和210.6μmol/L，不同國(guó)家之間無(wú)明顯差異。

以上研究均以多個(gè)樣本匯集成的樣本池為檢測(cè)對(duì)象，雖然也可反映母乳核苷酸的總體水平，為了更好地反映人乳核苷酸含量的個(gè)體差異，本研究采用了單個(gè)母乳樣本檢測(cè)法，結(jié)果顯示TPAN濃度中位數(shù)和上述研究結(jié)果相類(lèi)似。在母乳核苷譜組成上也以C為主，I的濃度最低，在超過(guò)半數(shù)的樣本中未能檢出。但是各種核苷的濃度中位數(shù)和上述研究報(bào)道的平均濃度有所差異，C和U的濃度較高，而G和A的濃度較低，而且不同個(gè)體樣本之間各種核苷濃度的差異明顯。這與本研究測(cè)定個(gè)體母乳樣本，而上述研究測(cè)定多樣本混合的母乳池有關(guān)。在不同階段母乳T(mén)PAN水平的比較上，本研究結(jié)果和前述研究不同，初乳的TPAN水平高于成熟乳。為了易于操作，本研究將初乳的采集時(shí)間定為出生后3～7天，此與標(biāo)準(zhǔn)的初乳定義有所不同，多種因素均可能影響核苷的測(cè)定結(jié)果，因此需要擴(kuò)大檢測(cè)樣本量以進(jìn)一步評(píng)估。

3.2 母乳核苷酸研究的問(wèn)題和展望

本研究首次報(bào)道了中國(guó)大陸地區(qū)母乳所含核苷的總體含量和成分特征，發(fā)現(xiàn)上海地區(qū)母乳T(mén)PAN的平均水平和核苷組成與歐美以及亞洲其他地區(qū)人群中應(yīng)用相同方法檢測(cè)所得結(jié)果相類(lèi)似，以胞嘧啶核苷濃度最高，而次黃嘌呤核苷僅在部分樣本中存在。

本研究采用的方法除母乳樣本的酶解時(shí)間有所延長(zhǎng)以外，基本與Leach等的方法相一致，因?yàn)闂l件所限，本研究未對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。由于母乳核苷酸的多元性和影響因素較多，母乳樣本收集流程、樣本處理和檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化也可能影響最終結(jié)果，迄今為止尚未得到公認(rèn)的母乳核苷酸評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和方法。除了Tressler等的研究基本采用Leach等的TPAN評(píng)價(jià)法外，Thorell等(1996年)的研究采用不同的方法也得到了相似的結(jié)論，但是Liao等[9]報(bào)道的臺(tái)灣地區(qū)母乳核苷酸特征卻存在較大的差異，因此需要通過(guò)進(jìn)一步的方法學(xué)論證研究選擇最佳的檢測(cè)方法，并擴(kuò)大檢測(cè)樣本的來(lái)源和數(shù)量以正確評(píng)估中國(guó)人群母乳核苷酸的含量和影響因素，為最終建立符合中國(guó)人群特點(diǎn)的嬰兒食品如配方奶粉的核苷酸添加標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

[1]俞莎,陳曉春,潘洪峰,等.UPLC-MS/MS法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中五種核苷酸的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,32(2):187-189.

[2]郝巖平,張秋梅,王象欣.嬰幼兒配方食品和乳粉中核苷酸的測(cè)定方法[J].中國(guó)乳品工業(yè),2011,39(4):48-52.

[3]Yau K I,Huang C B,Chen W,etal.Effect of nucleotides on diarrhea and immune responses in healthy term infants in Taiwan[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2003,36(1):37-43.

[4]Hawkes J S, Gibson R A, Roberton D,etal.Effect of dietary nucleotide supplementation on growth and immune function in term infants:A randomized controlled trial[J].Eur J Clin Nutr,2006,60(2):254-264.

[5]Arslanoglu S, Bertino E, Nicocia M,etal.WAPM Working Group on Nutrition:Potential chronobiotic role of human milk in sleep regulation[J].J Perinat Med,2011,40(1):1-8

[6]Timmermans M J, Daqnelie P C, Theunisz E H,etal.Dietary nucleotide and nucleoside exposure in infancy and atopic dermatitis, recurrent wheeze, and allergic sensitization[J].J Pediatr Gastroenterol Nutr,2015,60(5):691-693.

[7]Gill B D, Indyk H E, Manley-Harris M.Analysis of nucleosides and nucleotides in infant formula by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Anal Bioanal Chem,2013,405(15):5311-5319.

[8]Rodriguez-Gonzalo E, Dominguez-Alvarez J, Mateos-Vivas M,etal.A validated method for the determination of nucleotides in infant formulas by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry[J].Electrophoresis,2014,35(11):1677-1684.

[9]Liao K Y, Wu T C, Huang C F,etal.Profile of nucleotides and nucleosides in Taiwanese human milk[J].Pediatr Neonatol,2011,52(2):93-97.

[專(zhuān)業(yè)責(zé)任編輯：古桂雄]

低出生體重和先兆子癇可能與家族史相關(guān)

低出生體重和先兆子癇與家族史有關(guān)，這是2015年2月在圣迭戈(加利福尼亞州)舉行的母胎醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(懷孕會(huì)議)年會(huì)上展示的一項(xiàng)以色列研究成果。比爾謝瓦的索羅卡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的醫(yī)師對(duì)1991至2012年間在醫(yī)學(xué)中心出生的2 315位母親、女兒和孫子(女)的三元組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。分析結(jié)果表明，如果母親低出生體重，盡管調(diào)整了年齡和胎盤(pán)病理等因素之后，對(duì)于其后代低出生體重仍是一個(gè)重要的預(yù)測(cè)因子；對(duì)于先兆子癇也是同樣的結(jié)果，盡管調(diào)整了其他影響因素之后，這種情況也再次出現(xiàn)在后代中。研究報(bào)告作者Yehonatan Sherf表示：“母系家族有低出生體重或先兆子癇的孕婦應(yīng)該被告知關(guān)于這些后果的情況，并對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)密監(jiān)控”，從而使這些并發(fā)癥在早期階段就可以被檢測(cè)到。

Primary study on characteristics of human breast milk nucleosides in some areas of Shanghai

BU Jun1, SUN Jian-hua1, WU Sheng-mei2

(1.DepartmentofNeonatology, 2.BeingmateBreastMilkResearchCenter,ShanghaiChildren’sMedicalCenterAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,China)

Objective To explore the characteristics of human breast milk nucleotides in Chinese population by measurement of total potential available nucleoside (TPAN) in breast milk of women in some areas of Shanghai. Methods Totally 71 milk samples were collected from 56 healthy lactating women volunteers in Shanghai, including 39 colostrum samples (3 to 7 days after birth) and 32 mature milk samples (1 to 2 months after birth). All samples were processed by standard methodology. Nucleotides were enzymatically hydrolyzed to their constituent nucleosides, and free and hydrolyzed nucleosides were then measured by HPLC to yield TPAN value. Results The medium values were 100mol/L for cytidine, 47mol/L for uridine, 15mol/L for guanosine, and 21mol/L for adenosine, and they were found in all of the samples. Less than half of milk samples (32/71) contained inosine with low concentration, and the accumulation of the above four nucleotides were considered as TPAN with medium value of 193mol/L. There were differences in the value of uridine and guanosine between colostrum and mature milk (Zvalue was -2.64 and -2.13, respectively, bothP<0.05), and the TPAN value of colostrum was higher than mature milk (Z=-2.09,P<0.05).Conclusion The average TPAN level and the composition of nucleosides of breast milk from lactating women in Shanghai are similar to these in population in European, American and other Asian measured by the same methods. Cytidine is the predominant nucleoside in human milk, and inosine is found only in some samples.

breast milk；colostrum；nucleotides；nucleoside

2015-01-28

步 軍(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事新生兒臨床和營(yíng)養(yǎng)的研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.004

R174

A

1673-5293(2015)03-0409-03