李婷婷李光明△孫鳳飛王平張旭乾

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院南充市中心醫(yī)院腫瘤防治中心,四川南充 637000; 2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院南充市中心醫(yī)院病理科,四川南充 637000)

論 著

節(jié)律基因蛋白CRY1在食管癌及癌旁組織中的差異性表達(dá)及意義

李婷婷1李光明1△孫鳳飛1王平2張旭乾2

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院南充市中心醫(yī)院腫瘤防治中心,四川南充 637000; 2.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院南充市中心醫(yī)院病理科,四川南充 637000)

目的:探討節(jié)律基因Cry 1表達(dá)的CRY 1蛋白在食管癌中的表達(dá)及其與臨床意義。方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)40例食管癌組織,40例癌旁組織中CRY1的表達(dá)。結(jié)果:40例食管癌組織中CRY1的弱陽/陽性表達(dá)(免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分大于等于2分)率為17.5%,而40例食管癌旁組織標(biāo)本CRY1的陽性表達(dá)率為75%,兩組表達(dá)的差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。且表達(dá)強(qiáng)度與患者年齡、性別,腫瘤組織性質(zhì)、侵及深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯相關(guān)性。結(jié)論:Cry 1基因在正常組織中高表達(dá),而在食管癌組織中低表達(dá),可能作為一種抑癌基因影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

節(jié)律基因;Cry 1;食管癌;免疫組化

生物節(jié)律是所有生物都具有的一種內(nèi)源性周期性節(jié)律,由視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus,SCN)產(chǎn)生。目前發(fā)現(xiàn)的節(jié)律基因有:Period 1,2,3;Clock;Cry 1,2;Timeless;Cycle; Doubletime;Cryptochroe;Bmal 1等。已有部分研究報(bào)道在不同組織來源中表達(dá)存在差異性,并且有望成為預(yù)測(cè)某些疾病的分子標(biāo)記物。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在食管癌中,PER2蛋白是低表達(dá)的[1],在癌旁組織中高表達(dá),那么同樣作為節(jié)律基因Cry 1表達(dá)的CRY 1蛋白,它的表達(dá)程度是否存在差異,能否為我們?cè)\斷或治療食管癌提供方向,我們開展了以下實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)對(duì)象

40例食管癌組織均來自2010年-2011年我院收治的食管癌患者行根治性切除術(shù)后存檔的石蠟包埋標(biāo)本。40例患者中,男性27例,女性13例,年齡45～78歲,中位年齡56。術(shù)前均為行放化療。癌旁組織取自遠(yuǎn)離腫塊邊緣5 cm以上食管組織。切緣均無殘留。病理類型均為鱗癌。

1.1.2 主要試劑

免疫組織化學(xué)分析采用即用型二步法。一抗為多克隆兔抗人Cry1抗體(編號(hào):CRY1(H-84):sc-33177)購自Santa Cruz公司。二抗為通用型Polymer kit(編號(hào):PV-6000),購自北京中衫生物技術(shù)有限公司,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物試劑盒(編號(hào): ZLI-9017),購自北京中衫生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

石蠟塊制成5μm厚連續(xù)石蠟切片,脫蠟,梯度乙醇水化?？乖迯?fù)采用EDTA抗原修復(fù)液,1000 W加熱沸騰,修復(fù)時(shí)間為2.5 min,室溫自然冷卻。3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶,室溫孵育20 min,PBS洗2～3次。一抗(PBS稀釋至1:150) 37℃孵箱孵育2 h,PBS洗2～3次。二抗37℃孵箱孵育1 h, PBS洗2～3次。DAB37℃孵箱孵育8～15 min染色,顯微鏡下觀察,適時(shí)終止反應(yīng),蒸餾水沖洗2～3次。蘇木素復(fù)染,脫水、透明、封片、鏡檢。用已知CRY1陽性表達(dá)的組織切片作為陽性對(duì)照,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

CRY1染色以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕褐色顆粒為陽性。參考文獻(xiàn)[2]建立免疫組化染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。首先是染色強(qiáng)度評(píng)分:無染色為0分:細(xì)胞膜或胞質(zhì)呈現(xiàn)淡黃色顆粒,明顯高于背景為1分;細(xì)胞膜或胞質(zhì)呈現(xiàn)淺棕黃色顆粒為2分:出現(xiàn)大量深棕黃色顆粒為3分。然后根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)分:每片隨機(jī)觀察5個(gè)視野。計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中染色陽性細(xì)胞數(shù)。陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分;陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為1分;＞25%～75%為2分;＞75%為3分。染色強(qiáng)度評(píng)分與陽性細(xì)胞數(shù)比例的評(píng)分相加之和為總分(0-6分)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件包處理,顯著性差異比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示在正常癌旁組織中CRY1陽性表達(dá)率為75%(30/40),均著色于細(xì)胞漿和細(xì)胞核(圖1A)。食管癌組織中表達(dá)低(7/40,17.5%),且著色部位不規(guī)則(圖1B)。具體評(píng)分結(jié)果見圖2。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析,食管癌組織與正常癌旁組織中的CRY1差異性表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P＜0.01。

圖1 食管癌旁組織及食管癌組織CRY1免疫組化染色(400×)

此外我們依據(jù)評(píng)分,就患者的年齡、性別、腫瘤病理類型、腫瘤侵潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行相關(guān)性分析后,得出的結(jié)果如表2所示,CRY1的表達(dá)強(qiáng)度與上訴因素均無明顯相關(guān)性,(P＜0.05)。

圖2 食管癌旁組織及食管癌組織Cry1免疫組化染色評(píng)分結(jié)果

表2 CRY1表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分與相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

食管癌是川北地區(qū)的高發(fā)惡性腫瘤之一,我們深入研究其相關(guān)發(fā)病基因,是希望對(duì)食管癌的診斷及治療有較全面的認(rèn)識(shí)。

hCry 1(Cryptochrome 1,GeneBank Accession No.BC030519)基因位于染色體12q23.q24.1,全長3044 bp,含13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子。其基因編碼586 aa的蛋白質(zhì),分子量約為66 kDa。該基因能在身體各組織中表達(dá)。在果蠅和擬南芥中大量研究結(jié)果揭示,Cryptochrome可以被認(rèn)為是動(dòng)植物控制生物節(jié)律過程中感受光的主要的感光色素[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)Cry 1在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞中均有表達(dá),且存在24小時(shí)波動(dòng)性[5]。但是Cry 1與食管癌或食管癌細(xì)胞株相關(guān)的報(bào)道卻很少。

本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CRY在食管癌組織與癌旁組織中均有表達(dá),但表達(dá)強(qiáng)度存在差異性,在正常組織中高表達(dá),在食管癌組織中低表達(dá)。這種差異可能就是導(dǎo)致食管癌發(fā)生發(fā)展的因素之一。Nuri Ozturk[6]在P53基因突變小鼠敲除Cry 1基因后發(fā)現(xiàn)Cry 1的缺失可延緩腫瘤的發(fā)生,并延長小鼠的生存期。Cry可顯著影響細(xì)胞的增殖,它的缺失可能成為一個(gè)腫瘤發(fā)展的保護(hù)因子。Tokunaga[7]在08年報(bào)道Cry 1相較于正常卵巢組織,在卵巢癌中高表達(dá),在粘液腺癌和3期腫瘤中表達(dá)量有明顯下降。Cry 1有可能成為一個(gè)可預(yù)測(cè)卵巢上皮癌的分子標(biāo)記物。Takashi Oshima[8]等在研究結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn),CRY1的表達(dá)在腫瘤組織與癌旁正常組織中是相似的,無明顯差異。但食管癌的組織類型不同于卵巢癌,生物學(xué)行為也可能不同。這有待與大量的臨床標(biāo)本實(shí)驗(yàn)證實(shí)。另外,我們?cè)囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)在部分近胃或賁門的手術(shù)切緣標(biāo)本中CRY1表達(dá)較強(qiáng)。

另一方面,我們也發(fā)現(xiàn)CRY1蛋白在食管腫瘤組織與正常組織間的這種差異性表達(dá),與患者年齡、性別、腫瘤組織性質(zhì)、腫瘤侵及深度及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這五種因素,并無明確相關(guān)性?？赏茰y(cè)時(shí)辰基因Cry 1可能對(duì)食管癌的發(fā)生有一定影響作用,但在篩查或預(yù)測(cè)其腫瘤進(jìn)展、預(yù)后方面無確切意義,需要進(jìn)一步大樣本深入研究。

總之,CRY1在食管癌中的低表達(dá),癌旁組織中高表達(dá),說明生物節(jié)律紊亂與食管癌的發(fā)生有一定關(guān)系。

1 李婷婷,李光明,唐治蓉.PER2在食管癌及癌旁組織中的差異性表達(dá)及意義[J].四川生理醫(yī)學(xué)雜志,2011,33(4):153-154.

2 Wang LD,Shi ST,Zhou Q,et al.Changes in p53 and cyclin D1 protein levels and cell proliferation in different stages of human esophageal and gastricardia carcinogenesis[J].Int J Cancer,1994,59(4): 514-519.

3 Kume K,Zylka MJ,Sriram S,et al.m CRYl and mCRY2 are essential components of the negative limb of the circadian clock feedback loop[J].Cell,1999,98(2):193-205.

4 Vitaterna MH,Selby CP,Todo T,et al.Differential regulation of mammalian Period genes and circadian rhythmicity by cryptochromes 1 and 2[J].Proc Natl AcadSci USA,1999,96(21):12114 -12119.

5 張艷.生物節(jié)律相關(guān)基因BMALl和CRYl在肝癌發(fā)生發(fā)展中的功能和機(jī)制探討[D].上海:復(fù)旦大學(xué),2005.

6 Ozturk N,Lee JH,Gaddameedhi S,et al.Loss of cryptochrome reduces cancer risk in p53 mutant mice[J].Proc Natl AcadSci USA, 2009,106(8):2841-2846.

7 Tokunaga H,Takebayashi Y,Utsunomiya H,et al.Clinicopathological significance of circadian rhythm-related gene expression levels in patients with epithelial ovarian cancer[J].Acta Obstet Gynecol Scand 2008,87(10):1060-1070.

8 Oshima T,Takenoshita S,Akaike M,et al.Expression of circadian genes correlates with liver metastasis and outcomes in colorrectal cancer[J].Oncol Rep,2011,25(5):1439-1446.

Differential expression and clinical significance of CRY1 in esophageal carcinoma and adjacent tissues

Li Ting-ting1,Li Guang-ming1△,Su Feng-fei1,Wang Ping2,Zhang Xu-qian2
(1.Cancer Center of Nanchong Central Hospital,The Second Clinical School,North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637000;2.Department of Pathology,Nanchong Central Hospital,The Second Clinical School, North Sichuan Medical College,Sichuan Nanchong 637000)

Objective:To investigate the expression of CRY1 in esophageal carcinoma and adjacent tissue to analyze its clinical sig-nificance.Methods:The expressions of CRY1 in 40 cases of esophageal carcinoma and 40 cases of adjacent tissue were measured by imunohistochemistry.Results:Thirty-three specimens in esophagus carcinoma tissue present CRY1 negative expression and 7 cases weakly positive expression(the intensity of expression≥2:17.5%).While 40 specimens in adjacent tissue of esophagus carcinoma appeared CRY1 positive expression(the intensity of expression≥2:75%).There is significant difference between two groups(P＜0. 05).And,there was no significant correlation between the expression intensity and patient s’age,gender,tumor tissue nature, depth of invasion and numbers of lymph node metastasis.Conclusions:Cry1 perhaps influence the progression of esophagus cancer as a tumor suppressor gene.

Clock gene;CRY1;Esophagus carcinoma;Immunohistochemistry

2015-5-27)

李婷婷,女,住院醫(yī)師,主要從事腫瘤內(nèi)科臨床工作,Email: family861314@sina.com。

△通訊作者:李光明,男,教授,主要從事腫瘤時(shí)辰治療工作,Email: Liguangming99999@yahoo.com.cn。