孫虎芝，龐天津，張 燦，鄒 玲，劉文華，李文立，任慧英

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109）

隨著水貂養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，水貂疾病也越來越復(fù)雜。山東省是水貂養(yǎng)殖大省，每年夏天水貂出血性肺炎的發(fā)生都很頻繁，給養(yǎng)貂業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失［1］。綠膿桿菌是水貂出血性肺炎的主要病原，臨床較常見［2］。克雷伯菌屬于革蘭陰性桿菌，有大量黏性多糖形成的莢膜包覆，人醫(yī)臨床常見克雷伯菌引起感染的報道，水貂的則較少［3］。

山東省文登市某水貂養(yǎng)殖場2014年5月水貂發(fā)生出血性肺炎，發(fā)病水貂出現(xiàn)被毛逆亂，體溫升高，結(jié)膜蒼白，呼吸淺速，偶爾咳嗽，鼻腔有分泌物，站立不穩(wěn)，病死率極高，死亡的水貂鼻腔流出血沫。剖檢發(fā)現(xiàn)上呼吸道黏膜充血水腫，肺出血、充血，氣腫。本文對病死水貂進(jìn)行了一系列的微生物學(xué)診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

病死水貂的肺臟、肝臟采自山東文登某水貂場；普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品；葡萄糖蛋白胨水、糖發(fā)酵管、藥敏紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；PCR試劑，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 對病死的水貂，在無菌條件下進(jìn)行解剖，取肝臟、肺臟，用接種環(huán)劃線接種于普通培養(yǎng)基、血清培養(yǎng)基及麥康凱培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

1.2.2 生物學(xué)特性檢查 挑取單個菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡檢。挑取普通培養(yǎng)基上生長的單菌落分別接種于微量糖發(fā)酵管，同時按照常規(guī)方法［4］進(jìn)行三糖鐵試驗與IMViC試驗。

1.2.3 16SrRNA基因擴(kuò)增與測序 挑取單個菌落接種于LB肉湯中，37℃，170r／min振搖培養(yǎng)12h，菌液作為16SrRNA的PCR擴(kuò)增模板［5］。上游引物 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，下游引物5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′。擴(kuò)增目的片段為1 380bp。PCR反應(yīng)體系為：模板2.0μL，上、下游引物各1.0μL，Premix 12.5μL，無菌水8.5μL。反應(yīng)條件：94℃10min；94℃40s，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；最后72℃10 min。10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序。

1.2.4 藥敏試驗 將濃度為108個／mL的新鮮菌液涂布普通板，放置5min后，將24種藥敏紙片貼于平板表面，37℃培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果。按照CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性評價［6］。

1.2.5 基因序列同源性比對以及進(jìn)化樹分析 將測序結(jié)果提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性分析，初步獲得該細(xì)菌的基本信息。利用Blast進(jìn)行比對，進(jìn)一步分析同源性，同時構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果

將肝臟及肺臟組織接種普通細(xì)菌培養(yǎng)基、血清培養(yǎng)基及麥康凱培養(yǎng)基，均出現(xiàn)密集生長菌落。普通細(xì)菌培養(yǎng)基及血清培養(yǎng)基上的菌落為灰白色、邊緣整齊，生長速度快，挑取時出現(xiàn)明顯的拉絲，且血清板上菌落較大，在麥康凱上呈紅色菌落。細(xì)菌為革蘭陰性桿菌，有明顯的兩極濃染特征，且兩端不一樣大，并有許多短桿狀連接在一起。

該菌能夠分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖和甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；不分解蔗糖；IMViC試驗為“- ＋ --”特征。

2.2 16SrRNA基因擴(kuò)增與測序結(jié)果

對病原菌的16SrRNA基因片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，電泳顯示一條明亮條帶，與預(yù)期的1 380bp相符（圖1）。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行Blast比對發(fā)現(xiàn)，結(jié)果與已知的克雷伯菌的核酸序列同源性高達(dá)98%。結(jié)合細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果，確定該分離株為肺炎克雷伯菌。

通過對病原菌的16SrRNA測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)與吉林大學(xué)分離的克雷伯菌菌株B-3屬于同一分支，堿基序列的同源性高達(dá)98%，本研究分離的肺炎克雷伯菌與其他克雷伯菌的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2。

圖1 16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification result of 16SrRNA gene

圖2 核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree of nucleotide sequences

2.3 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果顯示，該肺炎克雷伯菌對諾氟沙星、頭孢吡肟、阿米卡星、磷霉素、左氟沙星、頭孢他啶、大觀霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、多黏菌素B及頭孢西叮敏感，對頭孢曲松、頭孢哌酮、鏈霉素及頭孢噻肟中等敏感，對氨芐西林、卡那霉素、紅霉素、林可霉素、四環(huán)素、頭孢噻吩、頭孢呋辛、頭孢唑啉及青霉素G耐藥。在24種藥物中，62.5%的藥物為敏感或中度敏感，37.5%的藥物耐藥。

3 討論

肺炎克雷伯菌是臨床常見的條件致病菌，也是呼吸道感染的重要病原菌之一，屬于腸桿菌科細(xì)菌。肺炎克雷伯菌能夠引發(fā)人的感染，臨床報道的也比較多，主要導(dǎo)致呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、尿路、膽道、傷口、導(dǎo)管及血流等的感染，對于新生兒來說，該類病菌感染的比例較高［7］。然而，對于肺炎克雷伯菌感染動物的報道卻很少。

肺炎克雷伯菌主要通過呼吸道感染，因此，高密度的水貂養(yǎng)殖使該類病原菌在暴發(fā)期更容易傳播，導(dǎo)致機(jī)體的免疫力低下。通過病死的水貂，可以明顯觀察到上呼吸道黏膜充血水腫、肺臟以及肝臟出血。藥敏試驗顯示該病原菌對青霉素以及常用的頭孢菌素均不敏感，這一點與人源分離株一致［8］。該病原菌具有很高的耐藥性，對于臨床禁用的氯霉素則比較敏感，可能與氯霉素長期對動物禁用有關(guān)。從不同地區(qū)、不同發(fā)病群體分離的肺炎克雷伯菌對藥物的敏感性有很大差異，因此，動物發(fā)生細(xì)菌病后，應(yīng)及時通過藥敏試驗篩選敏感藥物，指導(dǎo)生產(chǎn)用藥，以減少水貂養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。

［1］鐘世勛，遲珊珊，王 振，等.山東規(guī)?；B(yǎng)殖場毛皮動物多重感染病原學(xué)分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2014（11）：1770-1777.

［2］楊海燕，王 穎，張傳美，等.貂源綠膿桿菌分離株的鑒定、血清學(xué)分型及藥敏試驗［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（7）：127-131.

［3］胡本鋼，杜崇濤，雷連成，等.貂源肺炎克雷伯菌的分離與鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2011，33（8）：598-600.

［4］胡桂學(xué).獸醫(yī)微生物學(xué)實驗教程［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2006：47-60.

［5］王秋實，曹 冶，謝 晶，等.一種適合檢測養(yǎng)殖場環(huán)境中鏈球菌的PCR檢測方法［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2013（1）：30-33.

［6］楊沙沙，王喜仁，韓 杰，等.美國CLSI抗菌藥物敏感試驗操作標(biāo)準(zhǔn)（2010年版）部分變更內(nèi)容［J］.中國感染控制雜志，2010，9（4）：303-304.

［7］劉衛(wèi)國.肺炎克雷伯菌臨床分布及耐藥性分析［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2011（3）：192-193.

［8］胡志軍，潘曉龍，周東升，等.肺炎克雷伯菌感染的臨床分布及耐藥性監(jiān)測［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014（12）：2865-2867.