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        口服百草枯建立帕金森病模型及其評價研究

        2015-06-25 12:13:04羅烘權(quán)徐名襯鄭春華王玉玨吳麗紅顧為望
        動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2015年9期
        關(guān)鍵詞:紋狀體百草低劑量

        羅烘權(quán),袁 進(jìn),徐名襯,鄭春華,王玉玨,吳麗紅,顧為望*

        (1.南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心,廣東廣州510515;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院,廣東廣州510140)

        帕金森病(Parkinson’s disease,PD)又稱震顫麻痹(Paralysis agitans,Shaking palsy),是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)椎體外系退行性疾病。主要的病理特征是黑質(zhì)致密部大量多巴胺能神經(jīng)元的壞死,紋狀體內(nèi)多巴胺(dopamine,DA)含量減少。臨床上以靜止性震顫、肌強(qiáng)直、姿勢異常和運(yùn)動遲緩以及平衡功能障礙為主要表現(xiàn),可伴有記憶力減退、抑郁等精神障礙。PD與年齡、遺傳、環(huán)境等因素相關(guān),發(fā)病率有逐年增加并有年輕化的趨勢。近年來,農(nóng)藥(如百草枯)在飲水、食品中的殘留被認(rèn)為是PD的重要誘發(fā)因素[1-2]。有研究報道,國內(nèi)外農(nóng)民以及除草劑(如百草枯)暴露人群中帕金森病的發(fā)病率會相對增加[3]。

        百草枯(paraquat,PQ),也叫克蕪蹤、對草快等,被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。其結(jié)構(gòu)與經(jīng)典PD造模劑1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrehydropyridine,MPTP)及其活性代謝產(chǎn)物MPP+極為相似,具有與MPTP相似的神經(jīng)毒性作用。百草枯可通過皮膚接觸或吸入、經(jīng)服食沾有該除草劑的食物、飲用水進(jìn)入人體內(nèi)。

        國外已經(jīng)報道百草枯的暴露是帕金森病的一個重要致病因素[4]。國內(nèi)外常通過腹腔注射或腦內(nèi)注射或皮下注射百草枯建立小鼠、大鼠PD模型[5-7],這與人類的主要經(jīng)口暴露方式相差甚遠(yuǎn)。通過大鼠口服百草枯建立PD模型的研究尚未見報道。因此,本研究通過口服途徑使大鼠較長時間暴露于百草枯,模擬人類長期、慢性暴露于該除草劑建立大鼠的PD模型,為PD的發(fā)病機(jī)制及其防治研究提供理想的模型動物。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD大鼠(♂,220g~250 g)64只,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號:SCXK[粵]2011-0015)。

        1.1.2 主要試劑 200g/L百草枯,南京杜邦生物化工有限公司產(chǎn)品;DA、HVA、5-HT標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司產(chǎn)品。

        1.1.3 主要儀器 RC5C高速低溫離心機(jī),美國杜邦公司產(chǎn)品;PHS-2C精密酸度計,上海理達(dá)儀器廠產(chǎn)品;Waters HPLC系統(tǒng)(510輸液泵,420熒光檢測器,Baseline810色譜工作站);RD1112-OF-R-1鼠博士曠場實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)、RD1101-MWM-G鼠博士MORRIS水迷宮視頻分析系統(tǒng),上海移數(shù)信息科技有限公司產(chǎn)品;HF-240全自動生化分析儀,海力孚公司產(chǎn)品。

        1.2 方法

        1.2.1 試驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為4組,分別為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組,每組16只,每天分別按生理鹽水、5、10、20mg/kg百草枯給藥,連續(xù)灌胃4個月,監(jiān)測大鼠試驗(yàn)前后體重變化情況。

        1.2.2 行為學(xué)檢測

        1.2.2.1 日常行為觀察 主要觀察動物精神狀況,行為動作,給藥前后有無異常表現(xiàn)等。

        1.2.2.2 曠場試驗(yàn) 4個月后,每組隨機(jī)抽取8只大鼠進(jìn)行試驗(yàn),把大鼠分別放入100cm×100cm×45cm的曠場箱內(nèi),通過動物曠場實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)采集分析大鼠在5min內(nèi)的運(yùn)動總路程和中央活動時間。

        1.2.2.3 水迷宮試驗(yàn) 定位航行試驗(yàn):試驗(yàn)共歷時4d,4次/d,每次分別從4個不同象限將大鼠面向池壁放入水中,記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間,即為其逃避潛伏期。若大鼠在90s內(nèi)未找到平臺則由試驗(yàn)者將其引向平臺,潛伏期記為90s。大鼠爬上平臺后,讓其在上休息15s,之后再進(jìn)行下1次訓(xùn)練。將4次/d的算術(shù)平均值記為當(dāng)天的成績??臻g探索試驗(yàn):于第5天撤除平臺,在第1象限將大鼠面壁投入水池,視頻分析系統(tǒng)記錄其2min內(nèi)水中游泳路徑及穿過原平臺的次數(shù)。

        1.2.3 各組大鼠肝腎功能的檢測 試驗(yàn)結(jié)束時,3組大鼠中每組隨機(jī)抽取8只,用30g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后通過眼眶靜脈叢采集血液1.5mL,分離血清,測定 ATL、BUN、Cr。

        1.2.4 病理學(xué)觀察 將每組隨機(jī)抽取6只大鼠,采集肺、中腦組織并用100g/L甲醛固定后制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色。觀察各組大鼠肺、中腦黑質(zhì)部組織病理學(xué)變化。

        1.2.5 HPLC-FD法檢測多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量

        1.2.5.1 色譜條件 采用 Waters-510泵;Nucleosil-C18(4mm×250mm)色譜柱;流動相:5.89g/L檸檬酸三鈉緩沖液(用鹽酸調(diào)節(jié)pH為3.5)∶甲醇∶乙腈=85∶10∶5,經(jīng)0.45μm的濾膜真空抽濾;脫氣,流速1.0mL/min;柱溫:室溫。熒光檢測器波長設(shè)置為:激發(fā)波長280nm,發(fā)射波長315nm;以峰面積定量。

        1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的制備與測定 標(biāo)準(zhǔn)品制備:DA、HVA、5-HT分別溶解于10.05g/L HClO4中,濃度為0.5g/L,貯存于-20℃冰箱中;分析時將上述溶液稀釋成20μg/L作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。樣品制備:每組大鼠用30g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后快速斷頭取腦,在預(yù)冷的PBS緩沖液中剝離出紋狀體,經(jīng)干冰固化稱重后迅速置-80℃冰凍保存。測定時取出標(biāo)本置于勻漿器中,加入1mL預(yù)冷的HClO4,制成勻漿。于臺式冷凍離心機(jī)中15 000 r/min離心20min,取上清液0.22μm濾器過濾進(jìn)樣檢測。根據(jù)外標(biāo)法進(jìn)行定量,計算出樣本中各項(xiàng)指標(biāo)的濃度,并表示為ng/mg組織(濕重)。

        1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行分析,組間比較為Independent sample t檢驗(yàn),試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用±SD表示,P<0.05則具有統(tǒng)計學(xué)差異。

        2 結(jié)果

        2.1 日常行為觀察

        給藥1周后,與對照組相比,發(fā)現(xiàn)給藥的兩組部分大鼠出現(xiàn)拉稀和鼻孔出血;2周后中劑量組大鼠會出現(xiàn)呼吸急促,甚至出現(xiàn)嚎叫的現(xiàn)象、喂藥后豎毛、翹尾和異?;顫?,隨時間推移,以上癥狀逐漸減輕;4周后,中劑量組大鼠呆滯、反應(yīng)遲鈍;10周后,中劑量組部分大鼠動作僵硬和四肢震顫,且維持到試驗(yàn)結(jié)束;而低劑量組大鼠整個過程沒有明顯上述變化。另外,高劑量組大鼠在試驗(yàn)過程出現(xiàn)大量死亡(圖1),4個月后所剩大鼠數(shù)量無統(tǒng)計意義,因此,在進(jìn)行檢測時把高劑量組剔除。

        2.2 大鼠體重的變化

        由表1可知,造模前各組大鼠體重比較,差異不顯著(P>0.05),造模后各組大鼠體重都有明顯的增加,但組間差異不顯著(P>0.05)。

        表1 造模前后各組大鼠的體重比較Table 1 Comparison of body weights of rats among groups before and after modeling g

        2.3 曠場試驗(yàn)

        由圖2結(jié)果顯示,對照組大鼠5min內(nèi)中央活動時間是中劑量組的13.69倍,差異顯著(P<0.05),低劑量組的中央活動時間與對照組相比,差異不顯著(P>0.05)。各組大鼠5min內(nèi)運(yùn)動總路程分別為2 610.41cm±633.55cm、2 556.90cm±837.97cm、2 507.69cm±780.07cm,雖然對照組>低劑量組>中劑量組,但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn),各組間差異不顯著(P>0.05)。

        圖2 各組大鼠5min中央活動時間和運(yùn)動總路程Fig.2 The time in the center of open field and the total walking distance in 5min among groups of rats

        2.4 水迷宮試驗(yàn)

        定位航行試驗(yàn):在連續(xù)的4d的訓(xùn)練中,中劑量組和低劑量組與對照組相比,每天平均逃避潛伏期均增加,但是只有中劑量組與對照組比較,差異顯著(P<0.05);而低劑量組與對照組比較,差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

        空間探索試驗(yàn)統(tǒng)計結(jié)果表明,中劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)(2.14±0.69)與對照組(3.86±0.69)相比明顯減少,差異極顯著(P<0.01),但是低劑量組(3.14±1.57)與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。

        圖3 各組大鼠日均尋臺潛伏期Fig.3 Daily average escape latency time in each groups of rats

        2.5 肝腎功能檢測

        采血后測定BUN、Cr以及ALT指標(biāo),結(jié)果見表2。各組之間的腎功能(BUN、Cr)差異不顯著(P>0.05),而中劑量組的ALT雖然比低劑量組和對照組有所增高,但均差異不顯著(P>0.05)。

        表2 不同處理組的大鼠肝腎功能指標(biāo)變化Table 2 Changes of hepatic and renal function indexes in different treatment groups of rats

        2.6 病理學(xué)觀察

        2.6.1 中腦病理觀察 由圖4中A、B、C可以看出,對照組大鼠大致正常,中劑量組大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞大量萎縮,色素大量減少,膠質(zhì)細(xì)胞增生,低劑量組大鼠有輕度上述變化。

        2.6.2 肺組織病理觀察 由圖4中D、E、F結(jié)果顯示,中劑量組大鼠肺泡腔嚴(yán)重淤血,肺泡上皮壞死脫落,肺泡間質(zhì)中炎細(xì)胞浸潤,低劑量組大鼠肺組織損傷程度較輕,而對照組大鼠正常。

        2.7 紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)含量

        通過HPLC檢測測定結(jié)果顯示,中劑量組大鼠4個月后紋狀體中的DA及HVA含量較對照組均明顯下降,分別下降20.0%(P<0.01)和11.3%(P<0.01)。而低劑量組大鼠紋狀體中的DA和HVA含量較對照組也有下降,但差異不顯著(P>0.05)。5-HT檢測結(jié)果顯示,兩個試驗(yàn)組與對照組相比,差異不顯著(P>0.05)(表3。)

        圖4 中腦和肺組織HE染色結(jié)果(400×)Fig.4 The HE results of midbrain and lung tissue(400×)

        表3 各組大鼠暴露4個月后紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)的含量Table 3 The concentration of DA and its metabolites in the striatum of each groups of rats after 4moth exposure

        3 討論

        PD是常見于中老年人群的第二大神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,在我國大于65歲以上人群中的PD患病率為1.7%,且有逐年遞增的趨勢[8]。近年一項(xiàng)研究表明,到2030年50歲以上的中老年人患PD的人數(shù)會增加1倍,估計相當(dāng)于全世界900萬的人口[9]。PD作為嚴(yán)重危害老年人身體健康的神經(jīng)退行性疾病,對其進(jìn)行研究具有重要的國民保健和社會經(jīng)濟(jì)意義。

        近年來,雖然農(nóng)藥種類和使用方法不斷更新改進(jìn),用藥水平和殘留水平也在下降,但農(nóng)產(chǎn)品和加工食品中種類繁多的農(nóng)藥殘留,給食品安全問題帶來了隱患。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)常接觸農(nóng)藥、除草劑(如百草枯)的農(nóng)民,飲用被污染的河水、井水的居民,其PD發(fā)病率明顯增高[10]。

        通過試驗(yàn)研究不斷證實(shí)了百草枯具有致PD的神經(jīng)毒性作用。本試驗(yàn)通過灌胃給予大鼠百草枯稀釋液,模擬人類經(jīng)消化道暴露該除草劑的方式,大鼠出現(xiàn)了PD的臨床癥狀和中腦病變。與大量報道的其他研究方法一樣,大鼠出現(xiàn)自發(fā)活動減少、運(yùn)動遲緩、四肢震顫、腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞明顯萎縮、黑質(zhì)神經(jīng)元受損、膠質(zhì)細(xì)胞增生、DA及其代謝物含量降低等一系列變化。有報道稱帕金森患者焦慮障礙的發(fā)生率為3.6%~40%[11],曠場試驗(yàn)表明,口服中劑量百草枯的大鼠在進(jìn)入一個廣闊的空間后會產(chǎn)生一定程度的焦慮,Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果說明了其學(xué)習(xí)記憶能力也相對減退,這與對照組形成了鮮明的對比;從該研究各結(jié)果顯示,本試驗(yàn)采用的方法可以建立具典型PD樣行為學(xué)表現(xiàn)的疾病模型。

        人們常用腹腔或腦內(nèi)注射或皮下注射百草枯的方法進(jìn)行建立帕金森模型[5-7],采用單次或短期較高劑量多次給藥誘導(dǎo)出神經(jīng)元壞死的模型,這與生活中人類暴露于百草枯的方式完全不一致;且所用藥物大多為試劑級,價格昂貴;制備技術(shù)上,腦內(nèi)注射需立體定位特殊設(shè)備,有一定技術(shù)難度。雖丁正同等[12]已經(jīng)采用該方法在小鼠進(jìn)行研究,同為嚙齒類動物,來源容易,觀察方便,但小鼠個體小,在取腦組織研究等方面相對較難。本研究方法模擬了人類暴露該除草劑的方式,采用商用百草枯水劑,價格低廉,操作簡便,試驗(yàn)周期較長,符合了PD患者自然病程較長,病情進(jìn)展緩慢的特點(diǎn),較經(jīng)濟(jì)有效的進(jìn)行模型制備。

        近年來百草枯其神經(jīng)毒性作用被廣泛研究,但肺是百草枯毒性作用的靶器官。有研究表明,長期給予低劑量的百草枯,其慢性毒性作用主要對基底節(jié)造成損害而不產(chǎn)生肺毒性作用[3]。但本研究結(jié)果顯示,大鼠肺泡腔嚴(yán)重淤血,肺泡上皮壞死脫落,肺泡間質(zhì)中炎細(xì)胞浸潤,這表明該研究方法會對肺組織產(chǎn)生毒副作用,該毒副作用可能也是高劑量組的高死亡率原因。另外,雖然肝臟和腎臟是百草枯的主要代謝器官,但檢測結(jié)果顯示,本研究方法尚未損傷動物肝腎功能,這與相關(guān)報道[12]是一致的。

        綜上所述,百草枯可能是導(dǎo)致PD的環(huán)境因素之一。SD大鼠通過口服方式暴露于百草枯可以發(fā)生典型的PD樣改變,行為學(xué)方面出現(xiàn)日?;顒訙p少,震顫,學(xué)習(xí)記憶能力下降等;形態(tài)學(xué)方面大鼠中腦黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)細(xì)胞減少明顯;生化方面大鼠紋狀體中DA及其代謝物HVA降低明顯等等。這些結(jié)果提示,通過亞慢性暴露于百草枯可導(dǎo)致大腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的變化,說明該方法建立PD模型是有效可行的,這為PD的機(jī)制和治療研究奠定基礎(chǔ)。

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