張文靜，張志敏，崔艷艷，呂亞莉，張菲菲，王金鴻，曹樹(shù)軒，菅復(fù)春，王榮軍，張龍現(xiàn)，寧長(zhǎng)申＊

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002；2.陜西省微生物研究所，陜西西安710043；3.安陽(yáng)市一中，河南安陽(yáng)455000；4.河南正大畜禽有限公司，河南孟津471121）

在世界范圍內(nèi)，奶山羊飼養(yǎng)量呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，且擁有良好的市場(chǎng)前景，越來(lái)越受到人們的重視和青睞。我國(guó)有著悠久的奶山羊養(yǎng)殖歷史，是世界上奶山羊飼養(yǎng)最多的國(guó)家之一。近年來(lái)，我國(guó)奶山羊的存欄量也不斷上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2001、2004、2005、2008、2012年我國(guó)奶山羊存欄數(shù)分別為478萬(wàn)只、450萬(wàn)只、530萬(wàn)只、550萬(wàn)只、1 200萬(wàn)只［1-2］。羊奶具有營(yíng)養(yǎng)豐富、易于吸收等優(yōu)點(diǎn)，是營(yíng)養(yǎng)專家公認(rèn)最接近人奶的乳品，并被稱為“奶中之王”［3］。隨著人們生活水平的提高，羊奶及其產(chǎn)品的獨(dú)特營(yíng)養(yǎng)保健功能日益被消費(fèi)者認(rèn)可和接受。

無(wú)漿體病（Anaplasmosis），舊稱邊蟲(chóng)病，是由無(wú)漿體（Anaplasma）經(jīng)蜱等節(jié)肢動(dòng)物傳播而引起多種動(dòng)物和人的一種細(xì)胞內(nèi)專性寄生的血液傳染?。?-5］。該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報(bào)告的動(dòng)物傳染病，也是我國(guó)出入境動(dòng)物檢疫對(duì)象之一［6-7］。該病分布廣泛，綿羊和山羊均易感染。羊感染無(wú)漿體后，臨床特征以高熱、貧血、消瘦、黃疸為主，嚴(yán)重感染時(shí)會(huì)引起死亡。

為了解我國(guó)奶山羊無(wú)漿體病的流行情況，并為該病的防控提供科學(xué)參考和依據(jù)，本研究應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)河南、云南、陜西地區(qū)的奶山羊無(wú)漿體感染情況進(jìn)行了調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 2012年7月至2014年9月從河南?。尻?yáng)宜陽(yáng)、洛陽(yáng)澗西區(qū)、新密市、南陽(yáng)市西峽縣、開(kāi)封、平頂山、商丘寧陵縣）、云南?。ɡッ魇校?、陜西?。ǜ黄娇h、麟游縣、涇陽(yáng)縣、高陵縣）共12個(gè)縣區(qū)采集的血液樣品300份、羊奶樣品204份。血液樣品置于2mL EDTA-K2抗凝管內(nèi)；羊奶樣品置于已滅菌的10mL EP管內(nèi)；采集的樣品均置4℃冰箱保存待檢。

1.1.2 主要儀器及試劑 血液基因組DNA提取試劑盒，上海萊楓生物科技有限公司產(chǎn)品（批號(hào)為DK602-01）；DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及JY系列電泳槽，北京市六一儀器廠生產(chǎn)產(chǎn)品；6× DNA loading buffer、DNA Marker DL 2000、rTaqDNA Polymeras、dNTP Mixture、10×PCR buffer、BSA、LATaqDNA Polymeras、dNTP Mixture、10×LA PCR buffer等。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 用DNA提取試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)方法提取DNA。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增 牛無(wú)漿體（A.bovis）16S rRNA基因的擴(kuò)增：第一輪引物 EE1、EE2［8］，PCR擴(kuò)增條件為：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；第二輪引物AB1f、AB1r［9］，PCR擴(kuò)增條件為94 ℃ 5min；94 ℃1min，55 ℃ 1min，72 ℃ 1min，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。

嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體（A.phagocytophilum）的16 S rRNA基因擴(kuò)增引物：一輪引物 EE1、EE2［8］，二輪引物SSAP2f、SSAP2r［10］。擴(kuò)增條件同A.bovis。

綿羊無(wú)漿體（A.ovis）的MSP4基因擴(kuò)增：參考王貴強(qiáng)等［11］報(bào)道的一輪引物AMOf／AMOr和二輪引物MSP4f／MSP4r。第一輪PCR擴(kuò)增條件為94℃3 min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，25個(gè)循環(huán)；72℃10min；第二輪PCR擴(kuò)增條件為94℃3min；94℃20s，58℃20s，72℃1min，40個(gè)循環(huán)；72℃10 min。

以上引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳。每次PCR擴(kuò)增均設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照。

表1 無(wú)漿體PCR引物Table 1 Primers used for Anaplasma PCR

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

應(yīng)用 AB1f／r、SSAP2f／r和 MSP4f／r 3對(duì)引物對(duì)采集的300份奶山羊血液樣品和204份羊奶樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果共檢出A.phagocytophilum、A.bovis和A.ovis3種無(wú)漿體，片段長(zhǎng)度大小與預(yù)期一致（641、551、584bp）（圖1～圖3）。

2.2 不同地區(qū)奶山羊血液中無(wú)漿體感染情況

調(diào)查結(jié)果（表2）顯示，奶山羊血液無(wú)漿體總陽(yáng)性率為23%（69／300），其中，宜陽(yáng)、澗西區(qū)和新密市陽(yáng)性率達(dá)100%，麟游陽(yáng)性率較高為83.33%，而開(kāi)封、寧陵、昆明、涇陽(yáng)、富平未見(jiàn)感染。不同種無(wú)漿體的陽(yáng)性率存在差異，分別為A.phagocytophilum18%、A.bovis21.67%、A.ovis5.33%；陜西奶山羊3種無(wú)漿體的陽(yáng)性率分別為A.phagocytophi-lum20.09%（47／234）、A.bovis20.94%（49／234）、A.ovis6.41%（15／234），河南分別為A.phagocytophilum11.11%（7／63）、A.bovis25.4%（16／63）、A.ovis1.59%（1／63）。

2.3 不同品種奶山羊血液無(wú)漿體感染情況

不同品種奶山羊無(wú)漿體的感染情況不同，雜交奶山羊血液無(wú)漿體陽(yáng)性率（87.10%）明顯高于本地奶山羊陽(yáng)性率（28.57%）和關(guān)中奶山羊陽(yáng)性率（26.09%），而薩能奶山羊未見(jiàn)感染無(wú)漿體（表3）。

圖1 A.phagocytophilum16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of 16SrRNA gene of A.phagocytophilum

圖2 A.bovis 16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 16SrRNA gene of A.bovis

圖3 A.ovis MSP4基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of MSP4gene of A.ovis

表2 不同地區(qū)奶山羊血液中無(wú)漿體的感染率Table 2 The infection rates of Anaplasmas in blood of dairy goats from different regions

2.4 不同飼養(yǎng)模式奶山羊血液無(wú)漿體感染情況

放牧奶山羊無(wú)漿體陽(yáng)性率（48.20%）顯著高于舍飼羊無(wú)漿體陽(yáng)性率（17.39%）（表4）。

2.5 奶山羊血液中無(wú)漿體混合感染情況

300份奶山羊血樣中同時(shí)檢測(cè)出2種及其以上無(wú)漿體者占31%（93／300）。不同種無(wú)漿體混合感染情況見(jiàn)表5。

2.6 奶山羊羊奶中無(wú)漿體感染情況

共采集和檢測(cè)204份奶山羊羊奶樣品，僅在洛陽(yáng)澗西區(qū)的1份羊奶樣品中檢出A.ovis，陽(yáng)性率為0.49%（1／204）。

表3 不同品種奶山羊血液無(wú)漿體感染率Table 3 The infection rate of Anaplasmas in blood of dairy goats from different species of dairy goats

表4 不同飼養(yǎng)模式下奶山羊血液中無(wú)漿體的感染率Table 4 The infection rates of Anaplasmas in blood of dairy goats from different feeding patterns

表5 無(wú)漿體混合感染情況統(tǒng)計(jì)Table 5 The statistics of mixed-infection of Anaplasmas

3 討論

3.1 無(wú)漿體感染在陜西、河南奶山羊中普遍存在

2012年，孫明等［12］對(duì)我國(guó)甘肅省219份樣品的羊無(wú)漿體病調(diào)查顯示，ELISA檢測(cè)陽(yáng)性率為34.7%，PCR檢測(cè)為30.6%。2012年，Liu Z等［13］對(duì)我國(guó)中南部河南省、湖北省、貴州省和浙江省的262份羊血液樣品無(wú)漿體感染情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率高達(dá)73.9%。本試驗(yàn)對(duì)300份奶山羊血液樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，無(wú)漿體總陽(yáng)性率為23%，而在河南省為28.57%，陜西省為21.79%，兩省間奶山羊的陽(yáng)性率有一定差異；此外，各省不同地區(qū)奶山羊的無(wú)漿體陽(yáng)性率差異很大，可能與飼養(yǎng)方式有關(guān)。在云南昆明的3份奶山羊血樣中未見(jiàn)無(wú)漿體感染，因樣品量小，有待進(jìn)一步調(diào)查。

3.2 不同品種奶山羊無(wú)漿體感染率存在差異

目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)關(guān)于不同品種奶山羊無(wú)漿體感染情況的報(bào)道。本次調(diào)查顯示，雜交奶山羊血液中的無(wú)漿體陽(yáng)性率最高，達(dá)87.10%，本地奶山羊、關(guān)中奶山羊的陽(yáng)性率分別為28.57%、26.09%，3例薩能奶山羊未見(jiàn)無(wú)漿體感染。此結(jié)果是否與不同品種奶山羊?qū)o(wú)漿體的易感性等存在差異，有待進(jìn)一步探討。

3.3 放牧奶山羊血液中無(wú)漿體陽(yáng)性率顯著高于舍飼羊

有關(guān)羊無(wú)漿體病流行病學(xué)調(diào)查的報(bào)道多集中于放牧飼養(yǎng)的羊群［12-14］，而對(duì)舍飼羊的相關(guān)報(bào)道很少。孫明等［12］PCR檢測(cè)結(jié)果顯示甘肅省陽(yáng)性率為30.6%。Liu Z等［13］報(bào)道野外無(wú)漿體陽(yáng)性率高達(dá)73.9%。范德生等［14］的調(diào)查結(jié)果顯示新疆伊犁地區(qū)放牧羊的無(wú)漿體陽(yáng)性率為38.9%。本研究通過(guò)對(duì)不同飼養(yǎng)模式下奶山羊無(wú)漿體的感染情況調(diào)查結(jié)果顯示，放牧奶山羊的無(wú)漿體陽(yáng)性率為48.20%（67／139），顯著高于舍飼奶山羊的1.24%（2／161）。無(wú)漿體病屬蜱源性疾病，放牧奶山羊陽(yáng)性率高與在放牧條件下被硬蜱叮咬、傳播病原直接相關(guān)，因此，在養(yǎng)羊生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)硬蜱的防控。

3.4 奶山羊奶樣中無(wú)漿體陽(yáng)性率較低

目前尚未見(jiàn)有關(guān)于羊奶中無(wú)漿體感染情況的報(bào)道。本研究對(duì)204份奶山羊羊奶樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，僅在河南洛陽(yáng)郊區(qū)放牧加舍飼奶山羊的1份奶樣品中檢出A.ovis，奶樣中無(wú)漿體總陽(yáng)性率僅為0.49%（1／204），顯著低于血液無(wú)漿體陽(yáng)性率，可能與無(wú)漿體均寄生于血細(xì)胞內(nèi)而不易進(jìn)入羊奶中有關(guān)。

本調(diào)查顯示，無(wú)漿體在我國(guó)部分地區(qū)奶山羊中廣泛存在，給奶山羊養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)一定危害，尤其嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體屬人獸共患病原，臨床應(yīng)予以高度重視。雖然本調(diào)查顯示羊奶中無(wú)漿體的陽(yáng)性率較低，但在患病條件下，無(wú)漿體更易于隨血細(xì)胞進(jìn)入羊奶，因此應(yīng)加強(qiáng)羊病與血液及羊奶中無(wú)漿體的研究與監(jiān)測(cè)，為保障人、羊健康服務(wù)。

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