周才瑛，王先坤，劉 毅，劉 偉

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)（Haemonchuscontortus）屬于毛圓科（Trichostrongylidae）血矛屬（Haemonchus），是寄生在羊等反芻動(dòng)物皺胃和小腸內(nèi)的一種寄生蟲(chóng)，也叫捻轉(zhuǎn)胃蟲(chóng)［1］。剛采集的蟲(chóng)體為粉紅色，形似絲線。在該蟲(chóng)的前部有一圓形口囊，在此口囊內(nèi)有一圈長(zhǎng)矛狀的牙齒也被稱為背齒，寄居在宿主消化道特別是皺胃時(shí)，該背齒可咬住宿主的胃壁，并且長(zhǎng)度自由調(diào)整，以達(dá)到最佳汲血效果［2］寄生在山羊真胃與小腸末端時(shí)，主要食物來(lái)源為以山羊的血液與黏膜。據(jù)報(bào)道，2 000條捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)在皺胃黏膜寄生時(shí)，每天吸血量可達(dá)30mL。蟲(chóng)體吸血時(shí)或幼蟲(chóng)在胃腸黏膜內(nèi)寄生時(shí)，常以其蟲(chóng)體的前端刺入黏膜，引起損傷，可使胃腸的完整性受到損害，引發(fā)局部炎癥，使胃腸的消化、吸收功能降低。捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的毒素作用也可感染宿主的造血功能，加劇貧血，還能影響胃腸的蠕動(dòng)，減少消化液的分泌。因失血和血液再生能力的遭到破壞，家畜出現(xiàn)高度貧血，加之胃腸生理機(jī)能的擾亂，有的下痢，病畜常表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀［3］。

瀏陽(yáng)市是黑山羊養(yǎng)殖的主要地區(qū)，瀏陽(yáng)黑山羊是經(jīng)長(zhǎng)期選育，是全國(guó)少有的純黑山羊品種，1985年正式定名為瀏陽(yáng)黑山羊并編入《中國(guó)山羊》一書(shū)。瀏陽(yáng)黑山羊肌纖維細(xì)，硬度小，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，膻味極小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，其含鐵量比牛肉高出1倍、比豬肉要高出4倍之多［4］，具有滋陰壯陽(yáng)、延年益壽和美容之功效，尤其是對(duì)年老體弱、多病患者有明顯的滋補(bǔ)作用，老幼皆宜。在1982年，湖南省各山羊肉品評(píng)中名列前茅。但是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)是瀏陽(yáng)黑山羊養(yǎng)殖的一大隱患，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)直接的經(jīng)濟(jì)損失，影響?zhàn)B殖戶的收入。對(duì)瀏陽(yáng)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)流行感染情況進(jìn)行調(diào)查分析，通過(guò)分子生物學(xué)鑒定捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)，可以為瀏陽(yáng)黑山羊養(yǎng)殖提供相關(guān)信息，做到及時(shí)防治。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲(chóng)體樣品 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)樣品采自于瀏陽(yáng)關(guān)口鎮(zhèn)和瀏陽(yáng)龔家橋市場(chǎng)屠宰的黑山羊于2013年—2014年分別分季度采集，其中，第一季度采自瀏陽(yáng)關(guān)口鎮(zhèn)，代碼HC1、HC2，第二季度采自瀏陽(yáng)關(guān)口鎮(zhèn)，代碼HC3，第三季度采自瀏陽(yáng)龔家橋市場(chǎng)，代碼HC4、HC5，第四季度采自瀏陽(yáng)龔家橋市場(chǎng)，代碼HC6、HC7。

1.1.2 主要試劑 DNA 抽提試劑盒（Wizard○RSV Genomic DNA Purification System）；DNA Marker DL 2000，Promega公司產(chǎn)品；蛋白酶 K，美國(guó) Merk公司產(chǎn)品；PCR 試 劑（含 Mg2＋、buffer、dNTPs）、vTaqDNA酶，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；溴化乙錠（EB），美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；EDTA，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 取樣保存 取被宰殺羊的真胃置于相應(yīng)容器中，用手術(shù)刀將真胃打開(kāi)一小口，先檢查切口處，再用剪刀將其胃在容器中剖開(kāi)，將內(nèi)容物反復(fù)水洗沉淀，發(fā)現(xiàn)有蟲(chóng)體并取出來(lái)，放入生理鹽水清洗一下，放入700mL／L的酒精里保存。

1.2.2 蟲(chóng)體DNA的提取 在700mL／L酒精里取出1條蟲(chóng)子，放入培養(yǎng)皿內(nèi)清洗6次，每次洗5min，清洗后置于一新EP管中，用高壓滅菌過(guò)的眼科剪將蟲(chóng)子剪碎，加入裂解緩沖液200μL，混勻；然后加入20μL蛋白酶K（50μg／μL），蓋緊蓋子于振蕩儀上混勻，55℃恒溫水浴鍋中消化6h～9h，其間數(shù)次不定時(shí)的手搖動(dòng)和放于振蕩儀上振蕩，使蟲(chóng)子與裂解液、蛋白酶K充分接觸并裂解。消化好的蟲(chóng)體懸液按Promega公司的基因組DNA抽提試劑盒（Wizard○RSV Genomic DNA Purification System）使用說(shuō)明書(shū)提取蟲(chóng)體DNA，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 采用 Bowles J等［5］報(bào)道的引物：用于擴(kuò)增線粒體pcox1基因，pcox1保守引物的序列為JB3（上游引物）：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′；JB4.5（下游引物）：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′［4］反 應(yīng) 體系為：50μL體系，其中雙蒸餾水26.5μL；10×PCR buffer 5 μL；MgCl2（25mmol／L）8 μL；dNTPs（25mmol／L）4μL；Primer（50pmol／μL）1μL；Taqpolymerase（5U／μL）0.5μL；模板 DNA 1μL。反應(yīng)條件：先94℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃30s，共38個(gè)循環(huán)；再后72℃5min，最后4℃結(jié)束反應(yīng)。取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳后，用紫外投射儀觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，PCR產(chǎn)物放于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 pcox1序列測(cè)定及其在種系發(fā)育分析中的應(yīng)用 將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，用 DNA Star 5.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果研究分析。從GenBank TM檢索代表性的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)pcox1序列，然后與之進(jìn)行相似性比對(duì)和捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)種系發(fā)育分析，對(duì)獲得捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)pcox1序列使用Clustal X2.0及 Mega 4.1軟件進(jìn)行比對(duì)及獲取遺傳信息。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用Mega 4.1程序繪制。

2 結(jié)果

2.1 感染情況調(diào)查

從所檢查的結(jié)果可以看出瀏陽(yáng)黑山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)在不同的季度感染情況不同。具體感染情況見(jiàn)表1。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

試驗(yàn)7個(gè)樣品用上述引物均成功地?cái)U(kuò)增出約480bp的pcox1基因，與所需目的片段長(zhǎng)度相符，且無(wú)非特異性條帶，空白對(duì)照為陰性（圖1）。

表1 瀏陽(yáng)黑山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)各季度感染率Table 1 Seasonal infection rates of Haemonchus contortus in Liuyang black goats

圖1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)pcox1基因PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of Haemonchus contortus pcox1gene products by PCR

2.3 基于pcox1基因構(gòu)建種系發(fā)育樹(shù)

利用Clustal X2.0及 Mega 4.1軟件對(duì)7株捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)與GenBank中捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)pcox1基因（AB682706.1）進(jìn)行種系發(fā)育分析，以豬蛔蟲(chóng)（KF719142.1）作為外群，采用NJ建樹(shù)法構(gòu)建種系發(fā)育樹(shù)。種系發(fā)育樹(shù)顯示，7株（HC1～KI7）均與AB682706.1位于較近的分支上，其所屬的分支與外群相隔較遠(yuǎn)，能夠很好地得以鑒別。種系發(fā)育樹(shù)中的Bootstrap值較高（圖2）。

圖2 基于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)pcox1基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Haemonchus contortus based on pcox1gene sequences

3 討論

Jacquiet P等［6］采用糞檢法對(duì)雨季非洲西部多個(gè)國(guó)家的綿羊和山羊感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)感染率達(dá)80%～85%；Ningiga A 等［7］通過(guò)對(duì)PAPUAL地區(qū)實(shí)地考察羊感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)情況，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)綿羊感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)后的病死率可達(dá)40%；Achi Y l等［8］采用糞便漂浮法對(duì)法國(guó)Cote d＇Ivoire地區(qū)的74頭山羊和70頭綿羊進(jìn)行捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染率調(diào)查，發(fā)現(xiàn)95頭羊感染有捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)，感染率達(dá)66%；Bonfoh B等［9］也采用糞檢法對(duì)TOGO地區(qū)的60頭山羊和59頭綿羊進(jìn)行捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)有98頭羊受到感染，感染率為82%；Kumar R R等［10］于2001年-2006年5年采集西北印度地區(qū)養(yǎng)殖的羊的糞樣，并對(duì)當(dāng)?shù)匮蚋腥灸磙D(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)情況進(jìn)行調(diào)查，本次調(diào)查樣本中共包括9 261頭綿羊和7 262頭山羊，其中58.65%的綿羊和55.06%的山羊感染了捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)。

湖南省山羊捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染的調(diào)查情況如下。王喜軍等［11］采用剖檢法對(duì)湖南省炎陵縣龍溪鄉(xiāng)某養(yǎng)羊?qū)I(yè)戶的40余頭黑山羊感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)病情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)病死率為30%。王曉平等［12］采用剖檢法對(duì)湘西自治州花垣縣、保靖縣屠宰場(chǎng)所屠宰山羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染情況進(jìn)行調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，71頭山羊中有48頭受到感染，感染率為68%。

瀏陽(yáng)市捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染調(diào)查結(jié)果顯示，不同季度捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)感染情況不同，春季感染率為39.1%，夏季感染率為46.7%，秋季感染率為81.3%，冬季感染率為53.3%。本研究采用最簡(jiǎn)單方法的剖檢胃，不僅采用了洗滌胃內(nèi)容物方式進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查，還采用分子生物學(xué)的方法，通過(guò)PCR擴(kuò)增線粒體pcox1基因，鑒定了當(dāng)?shù)睾谏窖蚋腥镜哪磙D(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)蟲(chóng)種，圖片顯示線粒體基因的大小都為480bp左右。本研究結(jié)果為捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查以及分類鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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