尚江華，鄒雨汐，秦玲莎，徐如祥＊，姜曉丹＊

（1.廣東省腦功能修復(fù)與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東廣州510282；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院水牛研究所，農(nóng)業(yè)部（廣西）水牛遺傳繁育技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)發(fā)展到今天，已經(jīng)獲得了許多物種的后代［1］。而且，隨著該項(xiàng)技術(shù)與其他生物技術(shù)相結(jié)合，其研究重點(diǎn)已經(jīng)由以前的技術(shù)體系研究轉(zhuǎn)向生產(chǎn)和應(yīng)用的研究，如轉(zhuǎn)基因動物用以異種器官移植或乳腺生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)人源性的蛋白等［2-3］。同時，SCNT也成為獲得以治療為目的的克隆源性胚胎干細(xì)胞［4-5］以及以保存野生動物為目的的異種克隆的核心技術(shù)之一。家兔是一種使用廣泛的實(shí)驗(yàn)動物，在許多領(lǐng)域都用作動物模型。家兔與小鼠、大鼠等嚙齒類小型動物相比，其生殖特性及胚胎發(fā)育、著床機(jī)理等方面更接近人類，而且卵母細(xì)胞的顯微操作更容易進(jìn)行；而與大型動物相比，又具有超排獲得的卵母細(xì)胞較多、胎兒妊娠期短、實(shí)驗(yàn)成本低廉等特點(diǎn)，因此，在發(fā)育生物學(xué)尤其是胚胎工程方面，常常對家兔進(jìn)行超排處理以獲得更多的卵母細(xì)胞用于研究來闡述SCNT的原理與機(jī)制。采用兔卵母細(xì)胞為受體，已經(jīng)獲得了具有人遺傳信息的胚胎干細(xì)胞［6］，也獲得大熊貓-兔、貓-兔、獼猴-兔、野山羊-兔及食蟹猴-兔的異種克隆囊胚，甚至獲得早期妊娠胎兒［7］。因此，以較低的實(shí)驗(yàn)成本獲得更多的兔卵母細(xì)胞用于SCNT研究具有實(shí)際應(yīng)用價值。

為了獲得盡可能多的卵母細(xì)胞，母兔通常采用PMSG或FSH進(jìn)行超數(shù)排卵處理，超排方法的不同，不僅排卵數(shù)量上存在差異［8］，甚至對卵母細(xì)胞或者胚胎的質(zhì)量也會產(chǎn)生較大影響［9-10］。

家兔的核移植研究起步比較早，而且很早就成功獲得胚胎細(xì)胞核移植的后代，然而直到2002年才首次成功獲得了體細(xì)胞克隆兔［11］。當(dāng)前，用作體細(xì)胞核移植的兔卵母細(xì)胞大多數(shù)來源于體內(nèi)成熟后排出的卵母細(xì)胞，只有很少的研究采用體外成熟的卵母細(xì)胞［12］。為了從輸卵管內(nèi)獲得體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，研究者通常麻醉或者殺死兔子后將卵巢和輸卵管摘除，再在無菌條件下沖洗輸卵管來回收卵母細(xì)胞。在這樣的情況下，實(shí)驗(yàn)動物通常是一次性使用，卵巢上殘留卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞沒有得到利用。

對許多物種而言，抽吸自卵巢表面卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞通常被認(rèn)為是未成熟的，必須經(jīng)體外培養(yǎng)成熟后方可用于受精或核移植研究。然而，家兔是一種誘導(dǎo)排卵的動物，處于適當(dāng)發(fā)情周期的兔卵巢表面通常會有一些成熟待排的卵泡，只有在受到公兔交配或其他刺激（如激素誘導(dǎo)）后卵母細(xì)胞才從這些卵泡中排出。

家兔排卵通常發(fā)生在hCG注射后的10h～12 h，到14h排卵基本完成，但是在26h～30h，排卵后的卵巢上依舊存在很多未排出的大卵泡（直徑≥2mm）［13］。有研究報(bào)道注射hCG后10h～12h從家兔卵巢表面的卵泡上收集到成熟的卵母細(xì)胞成功體外受精并產(chǎn)下一只幼兔，證實(shí)此類卵母細(xì)胞的發(fā)育能力［14-15］，提示在超排結(jié)束（注射 hCG 14h）后，抽吸自兔卵巢殘留卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞可能用作核移植的胞質(zhì)受體。因此，本研究主要對抽吸自超排母兔卵巢表面卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞不經(jīng)體外成熟培養(yǎng)而直接用于體細(xì)胞核移植，并通過與沖洗自輸卵管內(nèi)的排出卵母細(xì)胞在顯微操作效率、體細(xì)胞克隆和孤雌生殖胚胎發(fā)育能力的比較研究，以檢驗(yàn)此類卵母細(xì)胞用作SCNT胞質(zhì)受體的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

TCM-199（含25mmol／L Hepes）和 DMEM，Gibco公司產(chǎn)品；孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（human choionic gonadotophin，hCG），分別購自天津華孚高新生物技術(shù)公司和寧波市激素制品有限公司；促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH），購自中國科學(xué)院動物所。其余試劑均為Sigma公司產(chǎn)品。細(xì)胞和胚胎培養(yǎng)的塑料器皿，購自美國Corning或丹麥Nunc公司。

實(shí)驗(yàn)動物是由廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的體重2.5kg以上、健康的成年新西蘭大白兔雌兔（實(shí)驗(yàn)動物合格證號：0008942，0009879）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物超數(shù)排卵 除特別說明外，實(shí)驗(yàn)動物的超數(shù)排卵處理參照已經(jīng)報(bào)道的方案進(jìn)行［16-17］。大白兔雌兔經(jīng)臀部肌肉注射150IU的PMSG 72h后，耳緣靜脈注射150IU的hCG進(jìn)行超排處理（PMSG＋hCG＋）。3只兔子注射等體積的生理鹽水來代替hCG用以檢測hCG注射與否對兔排出到輸卵管內(nèi)和卵巢卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞成熟度是否存在影響（PMSG＋hCG-）。另外，10只兔子采用FSH 和hCG聯(lián)合的方法進(jìn)行超排。即：大白兔雌兔經(jīng)臀部肌肉連續(xù)3d6次、每次間隔12h注射FSH。注射的劑量遞減，即第1、第2次劑量為0.15mg／只；第3、第4次劑量為0.10mg／只；第5、第6次劑量則為0.05mg／只。在最后一次注射FSH 12h后，耳緣靜脈注射150IU的hCG處理（FSH＋hCG＋）。hCG或生理鹽水注射后，人工刺激排卵。14h后 ，家兔用100mL／L水合氯醛麻醉后手術(shù)摘除卵巢、輸卵管和小部分子宮角。

1.2.2 卵母細(xì)胞的回收 排出卵母細(xì)胞的回收：剝離了多余組織的兔輸卵管用mM-199（100mL／L FBS的TCM-199）沖洗，回收卵丘-卵母細(xì)胞團(tuán)。卵巢卵母細(xì)胞的抽吸：選取卵巢表面直徑≥1mm的可見卵泡用10mL注射器套12號針頭抽吸、回收外層卵丘細(xì)胞包裹完整、胞質(zhì)均勻、形態(tài)好的卵丘-卵母細(xì)胞 復(fù) 合 體（cumulus-oocyte complexes，COCs）。沖出的卵丘細(xì)胞團(tuán)（內(nèi)裹有卵母細(xì)胞）或抽吸到的COCs分別在2g／L的透明質(zhì)酸酶中消化5min～10min，用內(nèi)徑略大于卵母細(xì)胞直徑的毛細(xì)玻璃管輕輕吹打去除外周包裹的卵丘細(xì)胞。200mL／L FBS的TCM-199終止透明質(zhì)酸酶的作用，再用mM-199洗滌2次～3次。選取具有第一極體（PB1）的成熟卵母細(xì)胞，依據(jù)卵母細(xì)胞獲取方式分組（抽吸組vs排出組）分別進(jìn)行SCNT和孤雌生殖的試驗(yàn)比較。

1.2.3 卵母細(xì)胞的去核和注核 選取具有第一極體（PB1）的成熟卵母細(xì)胞用含7.5μg／mL細(xì)胞松弛素B（CB）和mM-199處理10min～15min，再轉(zhuǎn)入添加有10μg／mL Hoechst 33342和7.5μg／mL CB的mM-199中染色處理10min。經(jīng)以上處理的兩組卵母細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入石蠟油覆蓋的50μL 5μg／mLCB的mM-199的顯微操作液滴中。去核時，用內(nèi)徑20 μm～22μm的斜口去核針刺破透明帶并插入到卵周隙內(nèi)，將PB1連同其下卵膜包圍的部分胞質(zhì)（含MⅡ期染色體核）吸去，再打開紫外光短暫照射吸出的胞質(zhì)檢查去核效果，同時看到PB1和中期核表明去核成功。去核成功的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入mM-199，在38℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、完全相對濕度的培養(yǎng)箱中靜置，等待注核。

1.2.4 供體細(xì)胞的準(zhǔn)備 COCs裸化過程中消化下來的卵丘細(xì)胞經(jīng)短期培養(yǎng)（6代以內(nèi)）后用作供體細(xì)胞。卵丘細(xì)胞用添加100mL／L FBS的DMEM在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、完全相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用前，先用無鈣鎂的PBS洗滌2次去除漂浮的死細(xì)胞，然后經(jīng)2.5g／L的胰酶消化成單個細(xì)胞后離心，再用mM-199重新懸浮并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個／mL。放入38℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、完全相對濕度的培養(yǎng)箱中等待備用。

1.2.5 核移植、電融合和重構(gòu)胚的激活 用斜口注核針選取表面平滑、形態(tài)完整的圓形細(xì)胞，單個注入卵母細(xì)胞的卵周隙內(nèi)，并使注入的體細(xì)胞緊貼卵母細(xì)胞的胞膜。體細(xì)胞-卵母細(xì)胞質(zhì)復(fù)合體采用電融合的方法融合。電融合儀為美國的Cyto-Pulse PA4000／PA-101S，融合槽為該公司的同心圓電極FE-C25／400，融合液采用該融合儀配套的專用融合液（CPS-LCM-C）。體細(xì)胞-卵母細(xì)胞質(zhì)復(fù)合體在融合液中平衡5min～10min后，移入充滿融合液的兩電極間，使卵裂球與卵母細(xì)胞胞質(zhì)間的接觸面與電場方向垂直，進(jìn)行融合。電融合參數(shù)為：場強(qiáng)為2 000V／cm，脈沖時程20μs，每次給予2個方波脈沖，間隔3s。融合后完整的重構(gòu)胚在mM-199中洗滌2次～3次后，采用離子霉素和6-二甲氨基嘌呤聯(lián)合處理的方式激活。先用含5μg／mL離子霉素（ionomycin）的 mM-199避光處理4min，mM-199洗滌3次，每次洗滌2min～3min，再移入含2 mmol／L的 6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）和 7.5 μg／mL CB的 mM-199中培養(yǎng)2.5h～3h。

1.2.6 重構(gòu)胚的體外培養(yǎng) 激活處理結(jié)束后SCNT胚胎先在體視顯微鏡用微細(xì)玻璃針輕輕滾動評估SCNT胚胎的融合情況，只有融合的重構(gòu)胚才用于體外培養(yǎng)。用于體外培養(yǎng)的SCNT重構(gòu)胚或孤雌胚用mM-199洗滌3次后移入50μL、上覆石蠟油的相同培養(yǎng)液的液滴中，在38℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、完全相對濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外培養(yǎng)直至第7天。每隔48h半量換入相同的新鮮培養(yǎng)液。體外培養(yǎng)的重構(gòu)胚在24h后觀察卵裂情況，并觀察記錄隨后胚胎的發(fā)育情況。

1.2.7 卵母細(xì)胞的孤雌激活 在體細(xì)胞-卵母細(xì)胞質(zhì)復(fù)合體（重構(gòu)胚）開始進(jìn)行電融合處理的同時，用作孤雌激活的卵母細(xì)胞也采用相同的參數(shù)、按照重構(gòu)胚激活程序同步進(jìn)行處理。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件的一般線性描述的方差分析（ANOVAPROC-GLM）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以檢驗(yàn)各處理間差異的顯著（P＜0.05時為差異顯著，P＜0.01時為差異極顯著）。

2 結(jié)果

2.1 不同超排方法獲得的排出或抽吸的兔卵母細(xì)胞數(shù)及其成熟情況

去除卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞以在體視顯微鏡下見第一極體（PB1）為標(biāo)準(zhǔn)判斷為成熟的卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞回收的結(jié)果如圖1所示，注射PMSG和生理鹽水處理（PMSG＋hCG-）的3只供體兔沖洗輸卵管沒有回收到任何卵母細(xì)胞，而抽吸卵巢表面的卵泡雖然獲得了62枚COCs（平均20.7±10.0枚），但是卻沒有成熟的卵母細(xì)胞；注射PMSG和hCG處理（PMSG＋hCG＋）的25只供體兔分別抽吸卵巢卵泡回收到246枚（抽吸組）和從輸卵管內(nèi)沖洗到得了277枚（排出組）卵母細(xì)胞，平均分別回收了9.8枚±6.5枚和11.1枚±5.0枚卵母細(xì)胞；而注射FSH和hCG處理（FSH＋hCG＋）的10只供體兔則分別回收了抽吸和排出卵母細(xì)胞108枚（平均10.8±3.0枚）和218枚（平均21.8±9.8枚）。FSH＋hCG＋處理平均回收的排出組卵母細(xì)胞顯著多于PMSG＋hCG＋處理（P＜0.05），而回收抽吸組卵母細(xì)胞平均數(shù)方面兩組差異不顯著（P＞0.05）（圖1A）?；厥章涯讣?xì)胞的成熟率抽吸組不如排出組，其中PMSG＋hCG＋處理和FSH＋hCG＋處理的抽吸組卵母細(xì)胞成熟率分別極顯著（70.7%vs94.6，P＜0.01）和顯著（81.5%vs94.6%，P＜0.05）低于排出組，而PMSG＋hCG＋處理的抽吸卵母細(xì)胞成熟率也顯著低于FSH＋hCG＋處理（70.7%vs81.5%，P＜0.05））（圖1B）。

2.2 抽吸或排出的兔成熟卵母細(xì)胞作為胞質(zhì)受體進(jìn)行SCNT的命運(yùn)

成熟卵母細(xì)胞在去核或注核后存活至顯微操作的下一步視為去核或注核成功。由表1可以看出，無論P(yáng)MSG＋hCG＋處理還是FSH＋hCG＋處理，抽吸組卵母細(xì)胞的去核成功率都顯著低于排出組（分別為：69.2%vs83.6% 和 71.6%vs80.8%，P＜0.05），但兩種超排處理獲得的兩類卵母細(xì)胞的注核成功率差異均不顯著（P＞0.05），而且在去核成功后用作SCNT胞質(zhì)受體注入卵丘細(xì)胞，獲得的重構(gòu)胚在融合率、分裂率、分裂胚胎發(fā)育至囊胚的比例差異均不顯著（P＞0.05）。但是，在總體效率方面，PMSG＋hCG＋處理的抽吸組卵母細(xì)胞要顯著低于排出組（8.4%vs11.5%，P＜0.05），而FSH＋hCG＋處理的抽吸組卵母細(xì)胞與其他組差異不顯著（10.2%vs11.6%，P＞0.05）。

圖1 不同激素超排處理回收兔抽吸和排出卵母細(xì)胞的平均數(shù)及成熟率Fig.1 Average number and maturation rate of oocytes recovered by aspirating ovarian follicles and by flushing oviducts from rabbits treated with different superovulation methods

表1 PMSG＋hCG＋和FSH＋hCG＋處理的兔排出或抽吸的成熟卵母細(xì)胞SCNT的命運(yùn)Table 1 SCNT fate of mature oocytes recovered by aspiration and ovulation from rabbits treated with PMSG＋hCG＋ and FSH＋hCG＋

2.3 抽吸或排出的兔成熟卵母細(xì)胞孤雌生殖胚胎的發(fā)育

3 討論

抽吸組和排出組成熟卵母細(xì)胞在孤雌激活處理后，卵母細(xì)胞的分裂率、胚胎發(fā)育至囊胚階段的比例及總體效率方面差異均不顯著（P＞0.05，表2）。

表2 PMSG＋hCG＋和FSH＋hCG＋處理的兔抽吸或排出的成熟卵母細(xì)胞孤雌生殖胚胎的發(fā)育情況Table 2 Developmental ability and total cell numbers of parthenotes derived from mature oocytes recovered by aspiration and ovulation from rabbits treated with PMSG＋hCG＋

超排兔卵巢卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞不經(jīng)體外成熟培養(yǎng)而直接用于體細(xì)胞核移植的研究，目前國內(nèi)未見相關(guān)報(bào)道。試驗(yàn)結(jié)果表明：抽吸組獲得的卵母細(xì)胞成熟率（具PB1卵母細(xì)胞的比例）極顯著（PMSG＋hCG＋處理為70.7%，P＜0.01）或顯著（FSH＋hCG＋處理為 81.5%，P＜0.01）低于排出組（94.6%），這與Brackett B G等［15］報(bào)道兔卵巢卵母細(xì)胞比排到輸卵管內(nèi)的卵母細(xì)胞成熟度差、體外受精效果低的結(jié)果相吻合。雖然抽吸組獲得的卵母細(xì)胞成熟率顯著低于排出組，但是與已經(jīng)報(bào)道的兔卵巢卵母細(xì)胞經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后用作體外受精或SCNT的成熟率相當(dāng)［12，18-19］。家兔排卵通常集中在激素處理后的10h～12h［13］并在14h完成［19］，但是在26h～30h，排卵后的卵巢上依舊存在很多未排出的大卵泡（直徑≥2mm）［13］。我們在hCG注射14h之后抽吸卵巢表面的卵泡依然能夠獲得較大比例的成熟卵母細(xì)胞，表明排卵結(jié)束后，依舊有成熟卵泡沒有破裂以致成熟的卵母細(xì)胞滯留在卵巢上。

在哺乳動物的超數(shù)排卵過程中，hCG通過模擬動物自發(fā)的LH峰起到誘導(dǎo)卵泡的成熟、破裂和排卵的作用。在家兔上，低劑量的hCG誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的核成熟，黃體化和卵泡的破裂需要高劑量的hCG［20］。本研究中，3只用生理鹽水代替hCG注射的供體兔沒有自輸卵管中沖洗到卵母細(xì)胞，而抽吸卵泡回收到的62枚卵母細(xì)胞都沒有成熟的結(jié)果印證了這一點(diǎn)（圖1）。這一結(jié)果也與Kobayashi Y等［22］通過用不同劑量的hCG體外灌注兔卵巢誘導(dǎo)卵泡排卵和卵母細(xì)胞成熟的結(jié)果相吻合。Varian N B等［13］用FSH和LH聯(lián)合超排母兔也發(fā)現(xiàn)低劑量的LH不能引發(fā)排卵，同時卵巢上有大量的未排大卵泡。

在顯微操作的效率方面，本研究結(jié)果顯示兩種不同超排處理獲得的成熟卵母細(xì)胞去核效率，抽吸組均比排出組要低（P＜0.05），而注核效率差異不顯著。目前，造成這種去核效率差異顯著的原因尚不清楚。

抽吸組和排出組的成熟卵母細(xì)胞去核成功后、用作胞質(zhì)受體注入卵丘細(xì)胞后的重構(gòu)胚在融合率、分裂率、分裂胚胎發(fā)育至囊胚的比例差異均不顯著，表明這兩類體細(xì)胞克隆胚胎具有等同的發(fā)育能力。Oh Y K等［23］對來源于超排兔卵巢卵泡和排出的卵母細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)以及體外受精胚胎發(fā)育的一系列變化進(jìn)行比較研究發(fā)現(xiàn)沒有顯著差異，Hayashi S等［24］也發(fā)現(xiàn)小鼠超排后用吲哚美辛（indomethacin）抑制排卵后卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞具有與排出卵母細(xì)胞等同的受精效果。

本研究中采用FSH超排比PMSG獲得了更多的兔排出卵母細(xì)胞，這結(jié)果與一些研究者報(bào)道的一致［8-9］，雖然，兩類抽吸組卵母細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)，但是前者抽吸獲得的卵母細(xì)胞成熟率更高（P＜0.05，圖1B）。兩種超排方法獲得的抽吸卵母細(xì)胞用作SCNT的總體效率雖然統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著，但與排出到輸卵管內(nèi)卵母細(xì)胞的SCNT總體效率相比較，PMSG抽吸組卻是顯著低于排出組（8.4%vs 11.5%，P＜0.05），而FSH 抽吸組卻差異不顯著（10.2vs 11.6%，P＞0.05）。

綜上所述，抽吸自排卵結(jié)束后超排兔卵巢表面卵泡內(nèi)的卵母細(xì)胞大多數(shù)都已經(jīng)成熟，雖然去核效果要差些，但去核成功的卵母細(xì)胞用作胞質(zhì)受體注入卵丘細(xì)胞后，獲得的重構(gòu)胚與用排出到的輸卵管內(nèi)的卵母細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚具有等同的發(fā)育能力，而且FSH超排獲得的抽吸組卵母細(xì)胞體細(xì)胞核移植的總體效率與排出到輸卵管內(nèi)的卵母細(xì)胞沒有顯著差別，可以不經(jīng)體外成熟培養(yǎng)而直接用于體細(xì)胞核移植，能夠在不增加試驗(yàn)成本的基礎(chǔ)上，大幅度提高可用卵母細(xì)胞的數(shù)量。

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