閆藝婷，潘耀謙，王 青，勾肖晶，劉 靜1，，黃亞明，楊激輝，劉興友＊

（1.河南科技學院動物科學學院，河南新鄉(xiāng)453003；2.畜禽智能化清潔生產(chǎn)河南省工程實驗室；河南新鄉(xiāng)453003；3.動物病毒病防控與藥殘分析河南省重點學科開放實驗室，河南新鄉(xiāng)453003）

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病。病雞主要的臨床表現(xiàn)為咳嗽、打噴嚏、生長發(fā)育遲緩、產(chǎn)蛋量減少和蛋的品質(zhì)下降等。另外，患雞的免疫機能下降，從而易繼發(fā)感染多種疾病。IBV可通過呼吸道和糞便快速傳播，一周內(nèi)可使整個雞群感染，具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴重阻礙了養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展［1］。

近年來不斷有新發(fā)現(xiàn)的IBV毒株的報道，如2012年埃及報道了一株可引起嚴重的呼吸道和腎病變的新型IBV［2］；2013年意大利北部報道了可導(dǎo)致病雞死亡率突增，并伴發(fā)腎組織壞死和腺胃炎的Q1株IBV［3］。臨床研究發(fā)現(xiàn)廣西新分離的8個IB毒株，與常規(guī)的Mass型疫苗株親緣關(guān)系較遠，起不到很好的免疫保護作用［4］，因此，傳統(tǒng)的活疫苗已不能很好的控制該病的發(fā)生。目前，深入研究新的毒株和新型疫苗成為控制該病的重點。2004年，劉興友等［5］發(fā)現(xiàn)一株對雞和鴨均易感的IBV新型毒株（IBV ZZ2004），用 PK15細胞、Vero細胞和雞胚成纖維細胞培養(yǎng)均未成功，目前僅能通過雞胚接毒傳代。通過用SPF雞胚對該毒株低溫誘導(dǎo)使其毒力減弱，獲得弱毒株IBV ZZ-V35。經(jīng)鑒定，IBV ZZV35具有良好的免疫原性和生物安全性，具有作為一種新疫苗毒的潛力。本研究旨在通過探針實時定量PCR方法檢測IBV ZZ-V35在雞胚尿囊液中的增殖規(guī)律，找出IBV弱毒在雞胚中增殖量最高的時間點，為研究弱毒苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 IBV ZZ-V35由河南科技學院實驗室保存。SPF雞胚，北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 MiniBEST Viral RNA／DNA Extraction Kit 5.0、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、Prime-STAR HS DNA 聚合酶、pMD19-T 載體、DH5α化學感 受 態(tài) 細 胞、Premix EXTaq（Probe qPCR），TaKaRa公司產(chǎn)品；凝膠DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；西班牙瓊脂糖。

1.2 方法

1.2.1 IBV ZZ-V35實時熒光定量PCR的建立 根據(jù)文獻［6］IBV ZZ2004全基因序列（JF705860.1）設(shè)計一對特異性引物和一條TaqMan探針。引物序列為F1（上游引物）：5′-AGGTAGTGGTGTTCCTGATAATGAG-3′，F(xiàn)2（下 游 引 物 ）：5′-ACGCATCTGGGACTGGTTTTC-3′，P（探針引物）：5′（FAM）-CCTGGCTTATACCTGGCTTGGCGTCT（Eclipse）3′，擴增為N基因的一部分，其產(chǎn)物大小為117bp，由TaKaRa公司合成并標記，用TE緩沖液稀釋到10nmoL／mL，置-20℃保存，備用。

1.2.2 RNA的提取及其反轉(zhuǎn)錄 將含IBV ZZV35弱毒的尿囊液反復(fù)凍融3次后，取含病毒的尿囊液200μL，按提病毒RNA試劑盒的步驟提取病毒RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將病毒RNA合成cDNA。

1.2.3 陽性模板的制備 PCR反應(yīng)體系總量為50μL：5× PrimeSTAR buffer 10 μL，dNTPs（2.5mmol／L）4μL，上、下游引物F1、F2各1μL，PrimeSTAR HS DNA 聚 合酶1μL，cDNA 模板2μL，高壓的去離子水31μL。反應(yīng)條件為：95℃3min；94 ℃ 10s，68 ℃ 2min，35個循 環(huán)；68 ℃10min。PCR產(chǎn)物用15g／L的瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段回收；16℃過夜，連接pMD19-T載體；轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，涂板氨芐固體培養(yǎng)基37℃12h～14h；挑取單個菌落，于氨芐液體培養(yǎng)基37℃、170r／min搖床過夜，按照質(zhì)粒提取說明書提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定為陽性重組質(zhì)粒，用蛋白核酸檢測儀，測定濃度后，作為陽性模板。樣品拷貝數(shù)（copies）＝（測得樣品濃度×阿氏常數(shù)）／樣品總分子量長度×660）。

1.2.4 實時定量RT-PCR標準曲線的建立 將已知濃度的標準陽性質(zhì)粒經(jīng)101～10710倍梯度稀釋，每個稀釋度設(shè)3個重復(fù)，Ct值為縱坐標，稀釋倍數(shù)的對數(shù)為橫坐標，建立標準曲線。熒光定量的反應(yīng)體系為20μL，ExTaq（2x）10μL，上、下游引物各0.4μL，TaqMan探針0.8μL，Rox Reference DyeⅡ0.2μL，cDNA 模板2.0μL，高壓去離子水6.2μL。熒光定量反應(yīng)條件為：95℃20s；95℃3s，60℃32s，40個循環(huán)。

1.2.5 IBV ZZ-V35感染SPF雞胚 孵化箱熏蒸消毒1h～2h，通風24h～48h，SPF雞胚用1g／L的KMnO4表面消毒后，置于預(yù)熱的孵化箱中。孵化條件為：37.8℃，濕度50%～60%，間隔2h自動翻蛋。弱毒尿囊腔原液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，接種于11日齡SPF雞胚0.2mL／枚，棄去24h死亡的雞胚。孵化至36、48、52、56、60、64、68、72、76、80、88、96、120、144h分別取樣。

1.2.6 感染樣品的采集及cDNA的制備 每個時間點取接種IBV ZZ-V35弱毒株的SPF雞胚3枚，無菌收集雞胚尿囊液，反復(fù)凍融3次后，取病毒液200μL，按照提取病毒 RNA／DNA 試劑盒提取RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，用已建立的實時定量PCR方法對每個時間點的樣品檢測，然后計算IBV ZZ-V35在不同時間按的拷貝數(shù)，以及3重復(fù)樣品之間的變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 陽性模板的制備

用設(shè)計的IBV ZZ-V35特異性引物，進行RTPCR擴增，結(jié)果顯示擴增出一條約117bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。將PCR產(chǎn)物回收，連接pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性重組質(zhì)粒。經(jīng)核酸蛋白測定儀，測得陽性重組質(zhì)粒的濃度為206×10-6g／mL。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物電泳Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR products

2.2 實時定量RT-PCR標準曲線的建立

IBV ZZ-V35的陽性質(zhì)粒經(jīng)實時定量PCR擴增，其擴增曲線和標準曲線見圖2和圖3。結(jié)果顯示，所建立的IBV ZZ-V35實時定量PCR方法在10-2～10-7倍稀釋范圍呈良好的線性關(guān)系，Ct值范圍是7.99～24.84，標準曲線的線性關(guān)系R2＝1，斜率為-3.277。log（copies／μL）＝（Ct-28.191）／-3.277。擴增效率（E%）為101.888。

圖2 IBVZZ-V35TaqMan探針熒光定量PCR擴增曲線Fig.2 Amplification curve of IBVZZ-V35TaqMan quantitative real-time PCR

圖3 IBV ZZ-V35TaqMan探針熒光定量PCR標準曲線Fig.3 Standard curve of IBV ZZ-V35TaqMan quantitative real-time PCR

2.3 IBV ZZ-V35在SPF雞胚中的增殖規(guī)律

用建立的IBV ZZ-V35探針實時定量PCR方法檢測感染該弱毒株不同時間的SPF雞胚尿囊液中IBVZZ-V35的含量。檢測結(jié)果顯示，SPF雞胚感染IBV ZZ-V3536、48、52、56、60、64、68、72、76、80、88、96、120、144h，尿囊液中病毒的平均拷貝數(shù)為1.416×106、1.791×106、2.056×106、3.027×106、3.664×106、1.854×106、1.380×106、1.109×106、7.976×105、5.408×105、2.958×105、2.512×105、4.365×104、1.130×104。變異系數(shù)為0.8%～2.1%。根據(jù)該弱毒株在SPF雞胚尿囊液中的病毒拷貝數(shù)繪制曲線（圖4）。

圖4 IBVZZ-V35感染SPF雞胚不同時間病毒的增殖曲線Fig.4 Proliferation curve of IBVZZ-V35in SPF chicken embryoes at different time post-infection

3 討論

實時定量PCR技術(shù)不僅在基礎(chǔ)研究和醫(yī)學領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，在畜牧獸醫(yī)學領(lǐng)域中也發(fā)揮了巨大的作用［7］。實時定量PCR技術(shù)分為相對定量和絕對定量。前者應(yīng)用較多的是SYBR Green染料法，后者是TaqMan探針法。SYBR Green染料能夠與所有的雙鏈DNA結(jié)合，故易出現(xiàn)非特異性擴增而影響檢測結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。TaqMan探針是根據(jù)合成片段設(shè)計的特異性探針引物，具有高度的特異性和敏感性。申偉霞等［8］研究表明雙重TaqMan探針實時定量PCR方法對H3、H9亞型流感病毒進行檢測，敏感度分別提高了100倍和1 000倍。Meir R等［9］研究表明TaqMan探針熒光定量可高效快速的檢測出臨床樣本中IBV。張鸛曉等［10］采用TaqMan探針方法可快速、敏感、特異的檢測到活禽中新城疫病毒中強毒株。梁耀峰等［11］TaqMan探針方法建立了IBV H52株的定量的檢測方法，比常規(guī)PCR敏感性高10倍。上述均表明了TaqMan探針方法具有明顯的特異性和敏感性，可作為病毒定性和定量的有效手段。

本研究主要通過TaqMan探針實時定量RTPCR方法繪制了IBV ZZ-V35在SPF雞胚中的增殖曲線，證明在52h～64h病毒的拷貝數(shù)較高，60h達到峰值，以后逐漸下降。這可能是由于通過雞胚傳代致弱的毒株，在雞胚中的適應(yīng)性逐漸上升，48h后雞胚死亡率有所上升，但此時弱毒株的增殖也趨于上升階段，但是隨著雞胚的生長，抵抗力增強，病毒的復(fù)制也出現(xiàn)下降趨勢，表現(xiàn)在64h后病毒增殖明顯下降。該毒株在細胞上培養(yǎng)還未獲得突破性的進展，通過雞胚尿囊液擴增病毒是其主要手段。通過TaqMan探針實時定量PCR能夠精確的檢測到雞胚尿囊液中病毒的含量，為傳染性支氣管炎病毒ZZ-V35弱毒株的研究提供了依據(jù)，更為今后IBV弱毒疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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