張文通，李 峰，魏 鳳，苗立中，吳家強(qiáng)，沈志強(qiáng)，，＊

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；3.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南250100）

豬圓環(huán)病毒?。≒orcine circovirus disease，PCVD）是由豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）感染引起豬的傳染病。PCV-2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的重要病原，主要感染5周齡～12周齡仔豬。病豬主要特征為體質(zhì)下降、消瘦、腹瀉及呼吸困難［1］。PCV-2對養(yǎng)豬業(yè)最大的危害是能破壞感染豬的免疫系統(tǒng)，造成免疫抑制，使感染豬對多種病原的易感性增強(qiáng)［1-2］。由PCV-2引起的豬只感染已相當(dāng)普遍，是給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的重大傳染病之一［3-5］。目前，關(guān)于PCV-2的研究，已成為畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域科研工作者研究的焦點(diǎn)之一。

近年來，關(guān)于PCV-2基因組存在差異的文獻(xiàn)不斷增多，不同地區(qū)分離的PCV-2存在遺傳變異［3-12］。因此，開展對PCV-2地方分離株的基因組序列分析，弄清其遺傳變異情況，將有助于PCV-2的防控。

本研究對來自濱州3個不同區(qū)域（濱州濱城區(qū)、濱州惠民縣和濱州沾化縣）疑似感染豬圓環(huán)病毒病的豬場病豬病料進(jìn)行PCR，結(jié)果均為陽性。初步診斷這3個豬場均存在PCV-2感染。利用PCR技術(shù)對這3個豬場病料分別進(jìn)行PCV-2全基因組的克隆及測序，得到這3個豬場的PCV-2基因組序列。分別將從濱州濱城區(qū)、濱州惠民縣和濱州沾化縣某豬場病料中得到的PCV-2全基因組，分別命名為BZ-1、BZ-2和BZ-3。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 3份疑似PCVD病料分別來自濱州濱城區(qū)、濱州惠民縣和濱州沾化縣某養(yǎng)豬場病死豬，病料均為無菌采集的病死豬淋巴結(jié)及肺臟。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒，北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TaKaRa ExTaq、10× ExTaqbuffer、dNTP Mixture、pMD18-T 載體、BamHⅠ、HindⅢ，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α菌種由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)［13］由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成PCV-2檢測引物，PCR擴(kuò)增核苷酸預(yù)期為1 154bp。引物序列為：P1：5′-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3′；P2：5′-ACCCCCGCCACCGCTACC-3′；參 照 GenBank 公布的PCV-2HN株（HM038021）設(shè)計(jì)一對用于擴(kuò)增全基因組的引物，引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為：P3：5′-TTTGGATCCGCTGGCTGAACTTTTGA-3′； P4：5′-AGCGGATCCAAATTTCTGACAAACGTTACA-3′。

1.2.2 疑似PCV-2感染病料的PCR鑒定 將無菌采集的病料組織，按照1∶3比例添加滅菌的8.5g／L氯化鈉溶液，用勻漿器進(jìn)行研磨；懸液反復(fù)凍融3次；然后以12 000r／min離心；上清用0.22 μm濾器過濾除菌并保存?zhèn)溆谩＿^濾后的菌液一部分用作提取DNA基因組的模板。

取部分濾液用試劑盒提取基因組DNA，具體操作按試劑盒說明書操作。以該基因組為模板，用P1和P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增25μL體系，具體為：10× ExTaqbuffer 2.5μL，dNTP Mixture（20mmol／L）1μL，P1和 P2（引物濃度均20 μmol／L）各0.5μL，TaKaRa ExTaq0.5μL，模板DNA 5μL，添加滅菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，62℃45s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 PCV-2全基因組PCR擴(kuò)增、克隆、鑒定及序列分析 以1.2.2獲得的基因組DNA為模板，用P3和P4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增25μL體系，具體為：10 × ExTaqbuffer 2.5μL，dNTP Mixture（20mmol／L）1μL，P3和 P4（引物濃度均20μmol／L）各0.5μL，TaKaRa ExTaq0.5μL，模板DNA 5μL，添加滅菌水至25μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94 ℃ 1min，56 ℃ 1min，72 ℃ 1 min 30s，35個循環(huán)后；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收，具體操作按試劑盒說明書操作。將回收到的PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體上，連接后的產(chǎn)物（濱州濱城區(qū)、濱州惠民縣、濱州沾化縣各PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體的連接產(chǎn)物，分別標(biāo)記為pT-BZ-1、pT-BZ-2、pT-BZ-3）經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確后，送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。用DNA Star軟件對測序結(jié)果與GenBank上公布的PCV-2基因核苷酸序列及氨基酸同源性分析，并繪制核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 疑似PCV-2感染病料的PCR鑒定結(jié)果

疑似PCV-2感染病料的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增到了與預(yù)期大小1 154bp相符的片段，結(jié)果見圖1。根據(jù)PCR鑒定結(jié)果初步判定來自3個豬場的病料均為PCV-2陽性。

2.2 病料中PCV-2的全基因組擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

病料中PCV-2全基因組PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴(kuò)增到了與預(yù)期大小1 767bp相符的片段，結(jié)果見圖2。連接產(chǎn)物pT-BZ-1、pT-BZ-2、pT-BZ-3經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測獲得了約1 800bp和2 600bp的片段，證實(shí)連接正確，結(jié)果如圖3所示。

圖1 PCV-2的PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of PCV-2

圖2 PCV-2全長基因組PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of PCV-2full-length genome

圖3 克隆質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of cloning plasmids by double enzyme digestion

2.3 PCV-2全基因組同源性比較及遺傳進(jìn)化分析

利用DNA Star軟件，將BZ-1、BZ-2及BZ-3的PCV-2全基因組測序結(jié)果與GenBank上公布的GU938303、GU938304、、HQ113120、HQ113121、HQ113117、 JN176181、 JX193799、 JX204386、HQ113119、KM245558、JX519293、 KJ956690、GU938302、KM460823毒株全基因組序列進(jìn)行核苷酸同源性比較。圖4顯示BZ-1株與GU938302株同源性最近（99.9%），與 HQ113120、JX193799同源性同源性最遠(yuǎn)（均為 95.9%），BZ-2 株 與KJ956690株同源性最近（99.8%），與JX204386同源性同源性最遠(yuǎn)（95.6%），BZ-3株與JN176181株同源性最近（99.8%），與JX193799同源性同源性最遠(yuǎn)（95.9%）。

圖4 PCV-2全基因組核苷酸同源性比較結(jié)果Fig.4 Homology comparison of the nucleotide of PCV-2genomic sequences

利用 MEGA 3.1軟件，繪制BZ-1、BZ-2及BZ-3與 GenBank上 公 布 的 GU938303、GU938304、HQ113120、HQ113121、HQ113117、JN176181、JX193799、JX204386、 HQ113119、 KM245558、JX519293、KJ956690、GU938302、KM460823PCV-2毒株全基因組核苷酸遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示。圖5顯示BZ-1株與BZ-3株處在同一分支，而BZ-2株處在另一分支。

圖5 PCV-2全基因組核苷酸遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of nucleotide of PCV-2 full-length genome

3 討論

PCVD是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，自1991年加拿大科學(xué)家首次報(bào)道本病以來，各個養(yǎng)豬大國相繼都有本病的報(bào)道，該病具有世界范圍流行的特點(diǎn)。GenBank上公布的PCV-2基因組大小有1 766、1 767、1 768bp 3種［10］。PCV-2通常含有11個閱讀框，其中編碼ORF2蛋白的核苷酸長度為702bp或705bp［10］。本研究的3個PCV-2分離株即BZ-1、BZ-2、BZ-3全基因長度均為1 767bp；BZ-1和BZ-3PCV-2分離株編碼ORF2基因核苷酸長度均為705bp，而BZ-2PCV-2分離株編碼ORF2基因核苷酸長度均為702bp。BZ-1和BZ-3PCV-2分離株編碼ORF2氨基酸同源性為99.6%，僅在169位有差異，其中BZ-1為R、BZ-2為G；而BZ-1、BZ-3與BZ-2PCV-2分離株編碼ORF2氨基酸同源性為94.9%，差異較大，尤其是在免疫活性表位113-136為發(fā)生變異。

關(guān)于PCV-2分離株變異報(bào)道的文獻(xiàn)逐漸增多，PCV-2按照基因型分為PCV-2a、PCV-2b、PCV-2c、PCV-2d、PCV-2e［7-12］。中國存在 PCV-2a、PCV-2b、PCV-2d，其中 PCV-2b是優(yōu)勢基因型［3-6］。PCV-2核苷酸遺傳進(jìn)化樹結(jié)果BZ-1、BZ-2、BZ-3 3個PCV-2分離株基因組均為PCV-2b基因型（GenBank顯示，HQ113121、HQ113120、JX193799、HQ113117、HQ113119等均為PCV-2b基因型）。

與BZ-1分離株同源性最近的GU938302毒株為2009年河南南陽分離株，與BZ-2分離株同源性最近的KJ956690毒株為2014年華南地區(qū)分離株，與BZ-3分離株同源性最近的JN176181毒株為2010年天津分離株。天津和河南均與山東相鄰，而華南區(qū)域與山東相隔較遠(yuǎn)，這說明濱州區(qū)域流行的PCV-2毒株具有廣泛性。本研究對濱州相關(guān)區(qū)域進(jìn)行PCVD疫苗防控提供了理論依據(jù)。

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