劉婷婷,謝芝勛,宋德貴,謝志勤,鄧顯文,謝麗基,黃 莉,羅思思,黃嬌玲,曾婷婷
(1.廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,廣西桂林541004;2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所,廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧530001)
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是單股負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒,屬于正黏病毒科A型流感病毒屬,其基因組長約13kb,含有8個(gè)基因節(jié)段,分別編碼 HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白[1-3]。其中HA、NA基因是兩個(gè)比較重要的基因節(jié)段,研究表明HA和NA基因之間存在某種平衡對(duì)病毒的致病性有很大關(guān)系[4],因此,在對(duì)AIV的研究中多將重點(diǎn)放在對(duì)HA和NA基因的研究。
H3N2亞型AIV是低致病性的,在禽類中呈隱性攜帶,被感染的禽類通常不發(fā)病或癥狀表現(xiàn)較輕,往往不被人們所注意。在對(duì)H3亞型AIV進(jìn)行分離純化、鑒定中發(fā)現(xiàn),H3N2亞型在H3亞型AIV中為較多組合的血清型亞型。同時(shí),在豬流感病毒與人流感病毒中H3N2亞型也為較常見亞型之一,這就為兩種宿主的流感病毒在豬"混合器"中發(fā)生基因重排提供了條件。因此,應(yīng)加強(qiáng)對(duì)H3N2亞型AIV的監(jiān)測,而傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法對(duì)NA亞型的檢測存在局限性。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR是一種將普通PCR方法與熒光檢測方法相結(jié)合的技術(shù),通過在PCR反應(yīng)體系中加入能與擴(kuò)增模板特異性結(jié)合并標(biāo)有熒光基團(tuán)的探針,監(jiān)測每一時(shí)刻產(chǎn)物的集聚程度[5]。該法具有操作簡便、結(jié)果直觀、敏感性高、特異性強(qiáng)、可定量檢測等特點(diǎn)。尤其是多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR在臨床多種病原混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特的優(yōu)勢[6-7]。目前,針對(duì)H3N2亞型AIV多重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法尚未見報(bào)道,因此,本研究建立了一種H3N2亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,旨在為H3N2亞型AIV的監(jiān)測提供一定的技術(shù)支撐。
1.1.1 主要試劑 DNA/RNA抽提試劑盒,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;pMD-18T試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光PCR Premix ExTaq,寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品;膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒,廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品。
1.1.2 毒 株 H1N1 、H3N2、H3N6 、H3N8、H4N2、H4N6、H6N1、H6N6、H6N8、H9N2 亞 型AIV由廣西獸醫(yī)研究所畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存,H5N1、H7N2亞型AIV RNA為香港大學(xué)惠贈(zèng),新城疫病毒(NDV)F48E9、傳染性支氣管炎病毒(IBV)H52、傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)北京株、雞毒支原體(MG)S6及禽呼腸病毒(ARV)S1733由廣西獸醫(yī)研究所畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。
1.1.3 其他 SPF雞胚,北京梅里亞公司產(chǎn)品;Lightcycler2.0熒光定量PCR儀,Roche公司產(chǎn)品。
1.2.1 引物與TaqMan探針的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中H3N2亞型AIV HA、NA基因保守序列,利用Primer Express3.0軟件,設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物和兩條TaqMan探針,并通過Blast驗(yàn)證,保證引物擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的靶基因,且不與其他亞型AIV發(fā)生交叉。引物與探針由TaKaRa公司合成,序列見表1。
表1 引物信息Table 1 Primer information
1.2.2 病毒RNA的抽提與反轉(zhuǎn)錄 參照DNA/RNA抽提試劑盒說明書提取各亞型AIV及NDV、IBV和ARV的RNA,并用隨機(jī)引物(9mer)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,將反轉(zhuǎn)錄的cDNA及抽提的ILTV、MG的DNA,置-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以 H3N2亞型 AIV的HA、NA基因全長通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,陽性產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后,連接到pMD18-T載體,提取陽性克隆質(zhì)粒AIV-H3和AIV-N2送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測序。參照Sambrook J的方法[8]測定核酸的濃度與純度,計(jì)算各質(zhì)粒的拷貝數(shù)。
1.2.4 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化應(yīng)用AIV-H3和AIV-N2質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,采用20μL PCR 反應(yīng)體系:real-time PCR premix 10μL,AIV-H3、AIV-N2引物和探針終濃度采用矩陣法在0.2μmol/L~0.8μmol/L之間調(diào)整,模板2μL,以ddH2O補(bǔ)足20μL。根據(jù)結(jié)果篩選出能夠檢測H3N2亞型AIV,且對(duì)Ct值和擴(kuò)增效率影響不大的引物和探針配比濃度,建立雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法。
1.2.5 敏感性試驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用含有目的片段的AIV-H3、AIV-N2質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)其進(jìn)行10倍系列稀釋后,將相同拷貝數(shù)的質(zhì)?;旌献鳛槟0暹M(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.6 特異性試驗(yàn) 利用優(yōu)化好的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系,對(duì)各亞型AIV和上述常見禽病病原體進(jìn)行擴(kuò)增,以ddH2O為模板作為陰性對(duì)照,對(duì)儀器中的每個(gè)檢測孔同時(shí)收集FAM和ROX兩種熒光信號(hào),確定該檢測方法的特異性。
1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照優(yōu)化好的雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,以1×108拷貝/μL的 AIV-H3和AIV-N2質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品,分為5個(gè)標(biāo)本同時(shí)檢測。通過計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差(S)和變異系數(shù)(CV)來驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光定量PCR的批內(nèi)重復(fù)性。在第4天、第7天后重復(fù)檢測保存于-20℃的模板,驗(yàn)證模板的穩(wěn)定性及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的批間重復(fù)性。
1.2.8 干擾性試驗(yàn) 將AIV-H3和AIV-N2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按不同濃度進(jìn)行組合(1×108和1×102;1×102和1×108;1×108和1×103;1×103和1×108),分別用雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和單重?zé)晒舛縋CR檢測,確定模板濃度相差較大時(shí)二者的檢測是否存在干擾。
1.2.9 臨床樣品檢測 抽提從廣西南寧市活禽市場采集的96份咽喉、泄殖腔拭子樣品的RNA,應(yīng)用所建立的H3N2亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR方法進(jìn)行檢測。同時(shí)對(duì)這96份樣品進(jìn)行抗生素處理后,用雞胚法分離病毒,用傳統(tǒng)血清學(xué)方法驗(yàn)證HA亞型的準(zhǔn)確性,通過普通RT-PCR擴(kuò)增NA基因,進(jìn)行克隆測序驗(yàn)證NA亞型準(zhǔn)確性。
通過對(duì)AIV-H3、AIV-N2引物對(duì)及探針終濃度的優(yōu)化,最終確定最佳反應(yīng)體系為real-time PCR premix 10μL,AIV-H3、AIV-N2引物和探針終濃度均為0.4μmol/L,模板2μL,以無RNA酶的超純水補(bǔ)足20μL,均勻混合,置Lightcycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30s;94℃10s,60℃20s,共40個(gè)循環(huán);40℃結(jié)束反應(yīng)。
將相同拷貝數(shù)的AIV-H3質(zhì)粒和AIV-N2質(zhì)?;旌献鳛槟0孢M(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖1,在FAM熒光通道(530nm激發(fā)光下)H3亞型AIV檢測下限為1×102拷貝/μL,根據(jù)Ct值和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值而建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=-3.23x+41.21(x代表模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值,y代表Ct值),在ROX熒光通道(610nm激發(fā)光下)(圖2)N2亞型AIV檢測下限為1×102拷貝/μL,根據(jù)Ct值和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值而建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=-3.28x+41.31,結(jié)果表明該法對(duì) H3N2亞型AIV的檢測下限為1×102拷貝/μL,且Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品的濃度具有良好的相關(guān)性。
特異性結(jié)果顯示,H3N2亞型AIV在FAM和ROX熒光通道均產(chǎn)生擴(kuò)增曲線,H3N6、H3N8亞型AIV在FAM熒光通道(530nm激發(fā)光下)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,在ROX熒光通道(610nm激發(fā)光下)為直線,H4N2、H7N2、H9N2亞型AIV在ROX熒光通道出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,在FAM熒光通道為直線,其他亞型AIV和常見禽呼吸道疾病病毒在FAM和ROX熒光通道檢測均為直線,與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符(圖3)。
圖1 H3亞型AIV的敏感性及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The sensitivity and the standard curve of real-time RT-PCR for H3
圖2 N2亞型AIV的敏感性及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The sensitivity and the standard curve of real-time RT-PCR for N2
圖3 Real-time RT-PCR特異性試驗(yàn)Fig.3 The specificity assay of real-time RT-PCR
在批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)中,對(duì)H3和N2亞型相同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合物作為模板進(jìn)行5次平行雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR,5個(gè)平行反應(yīng)在相應(yīng)的熒光通道下均獲得擴(kuò)增曲線(圖4),H3亞型AIV通道Ct值變異系數(shù)為0.31% ,N2亞型AIV通道Ct值變異系數(shù)為0.30% ,對(duì)上述模板,以相同反應(yīng)條件4d和7d后進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn),Ct值變異系數(shù)分別為1.28%、1.35%。結(jié)果表明,本研究建立的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性良好,可以滿足臨床檢測的要求(表2和表3)。
圖4 Real-time RT-PCR組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)Fig.4 The repeatability of real-time RT-PCR in one group
表2 組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)Table 2 Repeatability test in the group
表3 組間重復(fù)性試驗(yàn)Table 3 Repeatability test between groups
將AIV-H3和AIV-N2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板按不同濃度進(jìn)行組合時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)一個(gè)模板濃度高而另一個(gè)模板濃度低時(shí),仍可在不同熒光通道下分別檢測到2個(gè)模板,并與單項(xiàng)熒光PCR檢測的Ct值的變異不大。
應(yīng)用該法對(duì)96份臨床樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,檢出 H3N2亞型 AIV 4份(陽性率為4.17%),檢出單H3亞型AIV 1份(陽性率為1.04%),檢出單N2亞型AIV 17份(陽性率為17.70%),檢測結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致。
H3N2亞型AIV的致病力較低,在流行病學(xué)中的作用常被忽視。近年來,研究發(fā)現(xiàn)H3亞型AIV不僅可引起禽類的感染,也可以感染豬、馬、犬等哺乳動(dòng)物。由于流感病毒聚合酶保真性低,當(dāng)同一宿主同時(shí)感染多種流感病毒時(shí),容易發(fā)生基因重排,形成新的病毒毒株,造成對(duì)人類健康的威脅。1968年暴發(fā)的香港流感病毒A/HongKong/68(H3N2)經(jīng)研究證實(shí)就是由人的H2N2亞型流感病毒與H3亞型AIV的HA基因重排得來,其PB1基因也來自于AIV[9-10]。因此,建立一種快速檢測 H3N2亞型AIV的方法顯得尤為重要。
實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR是一種高敏感型、特異性、準(zhǔn)確可靠的一種檢測技術(shù),目前,應(yīng)用于多項(xiàng)病毒的檢測[11-16]。本研究針對(duì) H3N2亞型 AIV的HA基因和NA基因的保守序列,通過Primer Express 3.0軟件,設(shè)計(jì)并篩選出2套熒光TaqMan探針和引物,通過優(yōu)化引物與探針的配比濃度,建立了H3N2亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR。該方法具有較高的敏感性,可檢測到100拷貝/μL的H3N2亞型AIV;可一管檢出H3N2亞型AIV感染,也可鑒別單個(gè)H3亞型或N2亞型AIV的感染,且相互間沒有干擾,實(shí)現(xiàn)了一管二檢的目的,節(jié)省了成本。同時(shí),該方法對(duì)其他亞型AIV和常見禽病病原體的檢測均為陰性,表明本研究建立的H3N2亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有較高的特異性;通過重復(fù)性試驗(yàn)表明,Ct值變異系數(shù)均小于3%,檢測體系穩(wěn)定,具有良好的重復(fù)性。該雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR與普通RT-PCR相比,整個(gè)反應(yīng)過程僅需30min左右即可完成,而且不需要EB染色,減少了環(huán)境污染,整個(gè)擴(kuò)增過程可以通過電腦實(shí)時(shí)觀察,簡便、直觀,實(shí)現(xiàn)了對(duì)H3N2亞型AIV快速檢測的目的。因此,本研究所建立的H3N2亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR具有一定的有效實(shí)用性,對(duì)H3N2亞型AIV的早期診斷和有效防控具有重要意義。
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