盧 琴，李明波，彭先文，宋忠旭，雷 彬，梅書棋

（湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所／動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，湖北武漢430064）

豬丹毒（Swine erysipelas）是由豬丹毒桿菌（Erysipelotrixrhusiopathiae）引起的一種人畜共患傳染病，人感染后主要表現(xiàn)為皮膚紅疹的類丹毒，豬為皮膚有“打火印”疹塊和非化膿性關節(jié)炎。本病無明顯的季節(jié)性，各種年齡段的豬均易感，主要發(fā)生在3月齡～6月齡的架子豬。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，近年來，在安徽、黑龍江、廣州、江西、武漢等地均有豬丹毒散發(fā)流行性發(fā)生的報道［1-5］。

豬丹毒桿菌共有26個血清型，主要為1型和2型。豬丹毒桿菌的致病力的大小與血清型存在一定關系。Makino S等［6-8］認為SpaA蛋白對多種血清型的豬丹毒桿菌具有良好的免疫保護作用，還有許多學者［9-12］同時認為SpaA蛋白具有良好的保護作用，是研制豬丹毒桿菌亞單位疫苗的良好抗原，它所編碼的表面保護性抗原A由N端的免疫保護區(qū)域和C端的細胞結合區(qū)域組成。研究SpaA蛋白已成為研制豬丹毒疫苗的一個熱點。本文對病料組織的SpaA基因進行PCR檢測，再借助EXPASY軟件對測序結果進行翻譯，進行氨基酸同源性比對，將其中保守片段用于生物信息學分析，最終為研制豬丹毒桿菌新型疫苗及制備單抗提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 從來源于湖北某豬場病豬的肺臟、心臟等病料分離。

1.1.2 主要試劑 DNA Marker DL 2 000、DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠、TaqDNA聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 豬丹毒桿菌保護性抗原SpaA基因PCR引物合成 豬丹毒SpaA基因引物F-5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， R-5′-GGTACCTTGTTACGACTT-3′。預期擴增片段為1 531bp。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 豬丹毒桿菌DNA的提取 將組織用液氮研磨后加PBS懸浮，用DNA提取試劑盒提取。所有操作按照DNA提取說明書提取細菌DNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 豬丹毒桿菌SpaA基因的PCR檢測 以提取的基因組DNA為模板進行PCR反應，PCR反應條件：95℃ 5min；94℃1min，50 ℃ 40s，72 ℃1.5min，30個循環(huán)；72℃5min。PCR產(chǎn)物用10 g／L瓊脂糖凝膠電泳。膠回收后將純化的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 生物信息學分析 運用相應的生物信息學軟件進行預測。

2 結果

2.1 豬丹毒SpaA基因的PCR擴增結果

以所提取的菌株DNA為模板，進行SpaA基因的PCR擴增。取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)10g／L的瓊脂糖凝膠電泳后，得到了預期的1 531bp的目的條帶（圖1）。

圖1 SpaA基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of SpaA gene

2.2 豬丹毒SpaA蛋白的理化性質(zhì)分析

登錄 http：／／us.expasy.org／tools／protparam.html，對SpaA蛋白理化性質(zhì)分析：分子質(zhì)量（pW）為10.843 4ku、分子式C752H1216N212O218S4、等電點（pI）為8.08、消光系數(shù)（aliphatic index）為104.4，為脂溶蛋白、不穩(wěn)定系數(shù)為37.08，該蛋白分類為穩(wěn)定蛋白等理化特性。

圖3 SpaA蛋白跨膜區(qū)結果Fig.3 Transmembrane domain of SpaA protein

2.3 疏水性分析

登錄http：／／web.expasy.org／protscale／，利用Bio Edit軟件分析，結果顯示總平均疏水指數(shù)為-0.443，為親水性蛋白（圖2）。

圖2 SpaA蛋白疏水性結果Fig.2 Hydrophobicity of SpaA protein

2.4 跨膜區(qū)分析

使用 TMHMM Server v.2.0 在 線 分析（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM／），顯示SpaA蛋白無跨膜區(qū)（圖3）。

2.5 信號肽預測

使用SignalP在線分析（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／），無信號肽（圖4）。

2.6 跨膜螺旋區(qū)分析

使用COILS服務器分析（http：／／www.ch.embnet.org／software／COILS＿form.html），有兩處跨膜螺旋位點：64、80（圖5）。

2.7 蛋白質(zhì)二級結構預測

使用 SSPro4.0 服 務 器 預 測（http：／／scratch.proteomics.ics.uci.edu／），二級結構中有108個螺旋，6個伸展鏈和30個卷曲結構（圖6）。

2.8 蛋白質(zhì)磷酸化位點預測

登錄 http：／／www.cbs.dtu.dk／services／Net-PHos／，對SpaA蛋白磷酸化位點用NetPHos2.0軟件進行預測。結果顯示，該蛋白有5個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點有3個、蘇氨酸磷酸化位點有1個、酪氨酸磷酸化位點有1個（圖7）。

2.9 SpaA蛋白質(zhì)三級結構

登錄http：／／www.expasy.org／swissmod／SWISSMODEL.html中，在線分子建模服務器SWISS-MODEL，利用其已進行的PDB建模結果，用RASWIN軟件，對SpaA蛋白進行三級結構預測（圖8）。

圖4 SpaA蛋白信號肽結果Fig.4 Signal peptide of SpaA protein

圖5 SpaA蛋白磷酸化位點預測Fig.5 Phosphorylation site prediction of SpaA protein

圖6 SpaA蛋白二級結構Fig.6 Secondary structure of SpaA protein

圖7 SpaA蛋白磷酸化位點預測Fig.7 Phosphorylation site prediction of SpaA protein

圖8 SpaA蛋白質(zhì)三級結構預測Fig.8 Tertiary structure prediction of SpaA protein

2.10 B細胞抗原表位預測分析

使用神經(jīng)網(wǎng)絡等方法進行預測；Bcepred和Protean程序使用（http：／／www.imtech.res.in／raghava／bcepred／bcepred＿submission.html），B細胞抗原表位顯示：7～14、49～56、97～103、131～138。

3 討論

晏鵬飛等［13］發(fā)現(xiàn)豬丹毒桿菌表面保護性蛋白A起主要保護功能的核心區(qū)段為氨基端且是由抗體介導的免疫保護。Marani P等［14］克隆和表達了編碼SpaA蛋白N端的基因片段通過 Western blot檢測其免疫功能，結果表明該片段能夠防止豬丹毒桿菌對豬的感染。Sette A等［15］也通過表達豬丹毒桿菌SpaA蛋白N端區(qū)域免疫小鼠后小鼠可產(chǎn)生較強的免疫保護力。SpaA蛋白具有良好的免疫保護功能，是B細胞抗原表位分析的單參數(shù)方案：親水性、表面可及性、柔韌性、抗原性、二級結構預測及抗原指數(shù)，本試驗采用是多參數(shù)進行綜合分析，運用SSPro4.0服務器預測蛋白質(zhì)的二級結構，綜合可及性、親水性、抗原性、表位、柔韌性和極性等參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)SpaA蛋白的二級結構主要是以螺旋和卷曲為主，只有少量的伸展鏈，使得蛋白的分子構象緊密。SpaA蛋白含有5個磷酸化位點，這也說明豬丹毒桿菌能通過自我磷酸化并將下游調(diào)控蛋白磷酸化從而發(fā)揮致病作用；而親水區(qū)有助于穩(wěn)定球蛋白的構象并增加蛋白質(zhì)的水溶性，使藥物能透過細胞膜，使膜的通透性升高，從而發(fā)揮藥效。含有2個跨膜螺旋區(qū)，說明蛋白質(zhì)含有跨膜區(qū)提示它可能作為膜受體起作用，也可能是定位在膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白。本研究預測無跨膜區(qū)，這可能說明蛋白的編碼順序是不連續(xù)的，無信號肽、無跨膜區(qū)等參數(shù)表明該蛋白性質(zhì)較穩(wěn)定，提示蛋白可能實現(xiàn)較高量的可溶性表達，這與脂溶性的特性一致。綜合以上的結果，SpaA蛋白的分子質(zhì)量（pW）為10.843 4ku。等電點（pI）為8.08，為脂溶蛋白、不穩(wěn)定系數(shù)為37.08，總平均疏水指數(shù)為-0.443，為親水性蛋白，無跨膜區(qū)、無信號肽、有2個跨膜螺旋位點，二級結構中有108個螺旋，6個伸展鏈和30個卷曲結構。含有5個磷酸化位點，其中絲氨酸磷酸化位點有3個、蘇氨酸磷酸化位點有1個、酪氨酸磷酸化位點有1個，B細胞抗原表位主要有4處，即7～14、49～56、97～103、131～138。以上預測結果為今后開發(fā)豬丹毒桿菌表位疫苗和研究豬丹毒SpaA蛋白功能提供了新的思路。

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