秦 敏，鄒豐才，楊云慶，祝 賀，聶福平，王 煜，楊 俊，葉玲玲，周曉黎，艾 軍＊

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明650201；2.云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，云南昆明650228；3.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，四川重慶400020）

藍(lán)舌病、口蹄疫、小反芻獸疫和水泡性口炎分別是由藍(lán)舌病病毒（Blue tongue virus，BTV）、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）、小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）和水泡性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）引起的動(dòng)物急性傳染病，這4種病毒都可以引起反芻動(dòng)物發(fā)病，發(fā)病率極高，并能夠形成大范圍的流行，均被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病。

BTV存在25個(gè)血清型，每個(gè)血清型均為一種新的病毒。1994年-1997年間對(duì)我國云南、山西、四川、湖北、內(nèi)蒙古、新疆、西藏7個(gè)省區(qū)采集的7 158份4種反芻動(dòng)物（山羊、綿羊、黃牛、水牛）血清樣品進(jìn)行血清學(xué)分析，鑒定出BTV-1、2、3、4、12、15、16等7個(gè)血清型，其中BTV-1型和BTV-16型是主要的致病血清型。FMDV包括7個(gè)血清型：O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1型，每個(gè)型又可以進(jìn)一步分為不同的亞型。PPRV只有1個(gè)血清型，但根據(jù)基因進(jìn)化樹將該病毒分為4個(gè)系，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。VSV包括NJ型和IND型，在引起家畜發(fā)病的血清型中，NJ型占多數(shù)。

4種病毒在臨床上存在混合感染，同時(shí)均表現(xiàn)出精神沉郁，體溫升高，口腔黏膜、乳頭和蹄部冠狀帶等處發(fā)生水泡及潰瘍，在臨床診斷上不易區(qū)分，必須通過病原學(xué)進(jìn)行鑒別診斷。但傳統(tǒng)的病原分離耗時(shí)耗力，普通PCR檢測(cè)需要不同的反應(yīng)體系，耗時(shí)費(fèi)力。本研究通過分析比對(duì)，針對(duì)4種病毒的相對(duì)保守基因設(shè)計(jì)特異性引物，建立了BTV、FMDV、VSV、PPRV 4種病毒多重PCR快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與質(zhì)粒 BTV 4型、BTV 8型、BTV 9型、BTV 15型、BTV 17型、BTV 18型滅活病毒、FMDV O型、FMDV A型、FMDV AsiaⅠ型滅活病毒、PPRV疫苗株和 VSV NJ型、VSV IND型滅活病毒、正常BHK-21細(xì)胞由云南出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存；山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒由重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 Prime Script RT reagent Kit、Premix rTaqDNA 聚合酶、pMD18-T克隆載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；小量凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒，AxyGEN公司產(chǎn)品；乙醇、氯仿、異丙醇等，國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上公布的4種病毒的不同型的基因序列，利用MEGA5.2軟件找到針對(duì)BTV的NS3基因、FMDV的3D基因、PPRV的N基因和VSV的N基因序列的相對(duì)保守區(qū)，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)4對(duì)特異性引物（BTV登錄號(hào)：JX680466、FMDV 登錄號(hào)：X85493、PRRV登錄號(hào)：EU340363和VSV登錄號(hào)：AY383716）（表1）。引物設(shè)計(jì)好后，通過NCBI Blast對(duì)引物的特異性進(jìn)行比對(duì)，4對(duì)引物均具有良好的特異性。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 多重PCR引物信息Table 1 The information of primers for multiplex PCR

1.2.2 單重PCR引物驗(yàn)證 取BTV 4型、BTV 8型、BTV 9型、BTV 15型、BTV 17型、BTV 18型滅活病毒、FMDV O 型、FMDV A 型、FMDV AsiaⅠ型滅活病毒、VSV NJ型、VSV IND型滅活病毒和PPRV疫苗株按照Trizol Reagent說明書方法提取RNA，并按照Prime Script RT reagent kit試劑盒說明書將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行單引物單模板PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25μL，分別為Premix rTaqDNA 聚合酶12.5μL、上下游引物各1μL（20μmol／L）、模板cDNA 2μL，其余用去離子水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃5min；95℃30s，57℃45s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于20g／L瓊脂糖凝膠中，100V電泳40min后，觀察擴(kuò)增條帶。

1.2.3 陽性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 針對(duì)4種病毒的靶基因序列擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體上，構(gòu)建4種病毒的克隆質(zhì)粒。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化 對(duì)4種病毒的陽性克隆質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，計(jì)算其拷貝數(shù)，以108copies／μL作為模板，構(gòu)建多重PCR體系。以病毒的陽性克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（反應(yīng)體系為25μL），分別為 Premix rTaqDNA聚合酶12.5μL、引物4μL（2種引物各0.5μL）、模板2μL（4種質(zhì)粒各0.5μL），其余用去離子水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃5min；95℃30s，57℃45s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于20g／L瓊脂糖凝膠中，100V電泳40min后，觀察結(jié)果。

然后對(duì)多重PCR反應(yīng)的各引物濃度、反應(yīng)溫度、擴(kuò)增時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件變化如下：各引物濃度為0.15、0.3、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7 μmol／L；反應(yīng)溫度梯度為55、56、57、58、59、60℃；退火時(shí)間梯度為30、45、60s，篩選出多重PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)條件。

1.2.5 多重PCR特異性試驗(yàn) 采用兩種方法評(píng)估建立的多重PCR檢測(cè)方法的特異性。①將試驗(yàn)毒株（BTV、PPRV、VSV、FMDV）進(jìn)行人為的混合，利用多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，分析所建立的方法對(duì)4種病毒檢測(cè)的特異性；②利用多重PCR方法對(duì)反芻動(dòng)物易感的山羊痘病毒（GPV）、綿羊痘病毒（SPV）、牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSDV）進(jìn)行檢測(cè)，分析建立方法的特異性。

1.2.6 多重PCR敏感性試驗(yàn) 將攜帶PPRV N基因、BTV NS3基因、VSV N 基因、FMDV 3D基因的克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍遞減稀釋，使質(zhì)粒濃度為108copies／μL～101copies／μL。取各相同濃度質(zhì)粒人為混合后作為模板，按已優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，分析多重PCR的敏感性。

1.2.7 樣品檢測(cè) 應(yīng)用多重PCR檢測(cè)方法對(duì)PPRV細(xì)胞培養(yǎng)物、BTV4型、15型、17型細(xì)胞培養(yǎng)物，15份BTV臨床送檢樣品以及正常BHK-21細(xì)胞等20份樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 單重PCR驗(yàn)證引物特異性

利用設(shè)計(jì)的不同引物對(duì)，分別檢測(cè)相應(yīng)的病毒。通過對(duì)PPRV、BTV、VSV、FMDV不同型毒株進(jìn)行單重PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證引物的特異性。結(jié)果顯示引物特異性良好，以同一病毒不同型別毒株的cDNA為模板，均能以對(duì)應(yīng)的引物擴(kuò)增到相應(yīng)的目的片段（圖1～圖4）。

圖1 PPRV擴(kuò)增結(jié)果圖Fig.1 PCR results of PPRV

2.2 多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

對(duì)PPRV、BTV、VSV和FMDV 4對(duì)引物濃度、多重PCR擴(kuò)增溫度、時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)質(zhì)粒濃度為108copies／μL時(shí)，多重PCR反應(yīng)體系中以引物終濃度分別為 PPRV 0.65μmol／L、BTV 0.15 μmol／L、VSV 0.5 μmol／L、FMDV 0.7 μmol／L為佳；退火溫度為57℃（圖5）。在此條件下，多重PCR擴(kuò)增以如下反應(yīng)模式為佳：95℃5 min；95℃30s，57℃45s，72℃30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃保存。

圖2 BTV PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR results of BTV

圖3 VSV PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR results of VSV

2.3 多重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用優(yōu)化好的多重PCR反應(yīng)條件，對(duì)PPRV疫苗株、BTV 8型、VSV NJ型和FMDV AsiaⅠ型的cDNA模板人為混合后進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果含有PPRV、BTV、VSV和FMDV的核酸樣品均擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的目的條帶（圖6），分別為351、268、198、130bp，且無其他非特異性擴(kuò)增條帶。選取GPV、SPV、LSDV核酸樣品進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，結(jié)果均為陰性（圖7）。

圖4 FMDV PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR results of FMDV

圖5 PPRV、BTV、VSV、FMDV多重溫度梯度PCRFig.5 The multiple temperature gradient PCR of PPRV，BTV，VSV，F(xiàn)MDV

圖6 多重PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 The specificity results of multiplex PCR

圖7 多重PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 The specificity results of multiplex PCR

2.4 多重PCR敏感性結(jié)果分析

在引物終濃度分別為 PPRV 0.65μmol／L、BTV 0.15 μmol／L、VSV 0.5 μmol／L、FMDV 0.7μmol／L時(shí)，該多重PCR能檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)分別為 PPRV 103copies／μL、BTV 103copies／μL、VSV 103copies／μL、FMDV 102copies／μL（圖8）。

圖8 多重PCR敏感性擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 The sensitivity results of multiplex PCR

2.5 樣品檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用多重PCR體系對(duì)PPRV和BTV細(xì)胞培養(yǎng)物，BTV臨床送檢樣品以及正常BHK-21細(xì)胞等20份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，病毒細(xì)胞培養(yǎng)物檢測(cè)為陽性，正常BHK-21細(xì)胞和BTV臨床送檢樣品檢測(cè)均為陰性。利用現(xiàn)行國標(biāo)（BTV國家標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB／T 18089—2008；PPRV 國家標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB／T 27982—2011）檢測(cè)方法驗(yàn)證，與多重PCR檢測(cè)結(jié)果相同。

3 討論

多重PCR（multiplex PCR）是在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物，并能同時(shí)擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的多個(gè)核酸片段的PCR方法。該技術(shù)主要用于多種病原微生物的同時(shí)檢測(cè)或鑒定某些遺傳病及癌基因的分型鑒定等。多重PCR具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在同一PCR反應(yīng)管內(nèi)可以同時(shí)檢出多種病原微生物，或?qū)τ卸鄠€(gè)型別的目的基因進(jìn)行分型，另外，多種病原體在同一反應(yīng)管內(nèi)可以同時(shí)被檢出，將大大節(jié)省時(shí)間、試劑、經(jīng)費(fèi)開支。

本研究所建立的多重PCR方法能在一次的反應(yīng)中檢測(cè)出由PPRV、BTV、VSV和FMDV 4種病毒的核酸，通過對(duì)檢測(cè)方法的特異性、敏感性和臨床樣品檢測(cè)，初步表明該檢測(cè)方法可作為上述4種病原快速篩查的候選方法，具有一定的臨床應(yīng)用意義。

多重PCR的擴(kuò)增效率受到多種因素的影響，特異性引物的設(shè)計(jì)是多重PCR的關(guān)鍵，設(shè)計(jì)特異性引物首要考慮選擇的目的基因，在本研究中，主要是基于以下幾方面的原因選擇了多重PCR擴(kuò)增的目的基因：①BTV的保守基因，報(bào)道主要有編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的NS1和NS3基因，編碼病毒核衣殼蛋白的VP7基因。在現(xiàn)行的藍(lán)舌病病毒檢測(cè)的國家標(biāo)準(zhǔn)和OIE手冊(cè)推薦的PCR方法中，檢測(cè)的目的片段為BTV NS1基因；OIE手冊(cè)推薦的BTV熒光PCR檢測(cè)中，檢測(cè)的目的片段為NS3基因；部分論文報(bào)道的藍(lán)舌病病毒PCR檢測(cè)，檢測(cè)引物擴(kuò)增的目的片段為VP7基因。本研究中，利用 MEGA5.2軟件，分析了NCBI中藍(lán)舌病病毒1～24個(gè)血清型的VP7NS3 NS1基因片段的保守區(qū)，結(jié)合引物設(shè)計(jì)的原則，選擇了NS3基因作為本研究擴(kuò)增的目的片段。②PPRV的保守基因，報(bào)道主要是編碼核蛋白的N基因，核蛋白在病毒蛋白中含量最高，是病毒顆粒的主要組成部分。PPRV的國家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的RT-PCR檢測(cè)方法選用N基因作為目的基因，在對(duì)N基因的序列比對(duì)時(shí)，其保守性相對(duì)較好，因此，本研究針對(duì)PPRV N基因序列設(shè)計(jì)引物。③VSV的保守基因，報(bào)道主要是編碼核衣殼蛋白的N基因，N基因由422個(gè)氨基酸組成，呈現(xiàn)群特異性，為不同型的VSV所共有，且與其他彈狀病毒無任何的交叉反應(yīng)。VSV的行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的半套式RTPCR方法選用L蛋白基因較保守的序列作為PCR擴(kuò)增區(qū)，本研究中，我們利用 MEGA5.2軟件，分析了NCBI中報(bào)道的VSV不同型的L／N基因片段的保守區(qū)，結(jié)合引物設(shè)計(jì)的原則，選擇了N基因作為本研究擴(kuò)增的目的片段。④FMDV的保守基因，報(bào)道主要是5′UTR基因和3D基因。在現(xiàn)行的口蹄疫行業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，PCR檢測(cè)方法中檢測(cè)的目的基因?yàn)?′UTR基因，熒光PCR中檢測(cè)的目的基因?yàn)?′UTR基因和3D基因，同時(shí)在引物設(shè)計(jì)前期通過對(duì)FMDV的不同基因序列的保守性比對(duì)，選擇3D基因作為本研究中檢測(cè)口蹄疫病毒的特異性引物序列。本研究設(shè)計(jì)的4對(duì)特異性引物的G＋C%含量相近，Tm值相近，這就保證了在相同的退火溫度下，PPRV、BTV、VSV和FMDV的目的基因都能得到很好地?cái)U(kuò)增。在進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化時(shí)，4對(duì)引物的工作濃度對(duì)擴(kuò)增效率有很大的影響，然而，退火溫度對(duì)擴(kuò)增效率的影響不大，通過對(duì)引物的退火溫度的優(yōu)化結(jié)果圖可知55℃～60℃均可，因此選擇一個(gè)中間溫度進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。但是在多重PCR擴(kuò)增過程中，仍有不同程度的引物二聚體形成，需進(jìn)一步克服研究。

本研究應(yīng)用建立的方法對(duì)BTV、PPRV感染的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行了檢測(cè)，均能檢出相應(yīng)病毒核酸。對(duì)15份臨床抗凝血、組織樣本的檢測(cè)中，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。同時(shí)用國標(biāo)推薦的檢測(cè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，均為陰性。本研究中，由于PPR、VS、FMD臨床樣品收集較困難，未能對(duì)本方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，在今后的試驗(yàn)中，將進(jìn)一步增加所建立方法對(duì)臨床樣品檢測(cè)的應(yīng)用研究，使本研究建立的多重PCR方法更適合臨床檢測(cè)應(yīng)用。

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