曹利利，姚新華，郭衍冰，王英賀，，任科研，3，魏 峰，苑淑賢＊

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春130062；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118；3.吉林省畜牧獸醫(yī)總站，吉林長春130062）

雞球蟲病是一種危害極其嚴(yán)重的寄生蟲病，它是由艾美耳球蟲屬寄生于腸道所引起的，其中以柔嫩艾美耳球蟲危害最為嚴(yán)重，該病嚴(yán)重影響家禽的生長發(fā)育，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。目前，雞球蟲病主要以藥物防治為主，但存在耐藥性和藥物殘留等問題［2］。因此，疫苗免疫已成為預(yù)防雞球蟲病的主要措施［3］。目前，雞球蟲疫苗主要以強(qiáng)毒活疫苗和致弱苗為主，雖然顯示出良好的免疫效果［4-5］，但是由于活疫苗存在潛在的致病力、生產(chǎn)成本高、運(yùn)輸保存困難等缺點(diǎn)［6］，使得基因工程疫苗的研制成為雞球蟲疫苗發(fā)展的必然趨勢［7］。

近年來，雞球蟲的重組疫苗得到廣泛的研究，利用細(xì)菌、真菌、藍(lán)藻、植物等表達(dá)系統(tǒng)可以源源不斷地制備出球蟲的保護(hù)性抗原［8-10］?？ń槊纾˙acillus Calmette-Guerin，BCG）是一種減毒的牛分支桿菌，其毒性較弱，而且本身作為一種免疫佐劑具有很強(qiáng)的生物免疫調(diào)節(jié)功能，是被人們認(rèn)可的活菌苗［11］。目前，已利用卡介苗表達(dá)了多種疾病抗原，為抗細(xì)菌、病毒和寄生蟲病疫苗的研制提供確實(shí)的材料。

表面抗原蛋白是一種入侵相關(guān)蛋白，在宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中起重要作用。由于雞球蟲是一種寄生于腸內(nèi)的原蟲，因此在球蟲感染的入侵階段，蟲體的表面抗原能夠刺激宿主的先天性保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而避免健康雞的腸上皮細(xì)胞受到蟲體的入侵。研究表明子孢子和裂殖子生殖階段是球蟲入侵最危險(xiǎn)的階段［12］。柔嫩艾美耳球蟲SAG2抗原是柔嫩艾美耳球蟲在第二裂殖子階段進(jìn)行表達(dá)的表面抗原，是球蟲入侵相關(guān)蛋白之一，具有良好的抗原性［13］。

本研究將柔嫩艾美耳球蟲SAG2基因克隆到大腸埃希菌-分支桿菌整合表達(dá)載體pMV361中，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pMV361-SAG2，電穿孔轉(zhuǎn)染到卡介苗中高效表達(dá)，為重組卡介苗作為球蟲病疫苗的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 卡介苗，購自長春生物制品所；整合表達(dá)載體pMV361和大腸埃希菌DH5α，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ和DNA片段純化回收試劑盒等，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成及RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中SAG2基因序列及pMV361載體物理圖譜設(shè)計(jì)兩對引物并引入酶切位點(diǎn)：上游引物5＇-CAAGCTTATGTCTCGCCTGGCCTCTG-3＇，5＇端含有HindⅢ位點(diǎn)，下游引物5＇-GGAATTCTTAAAAAAGCCCGTAAGCAAAAA GC-3＇，5＇端含有EcoRⅠ位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用RT-PCR擴(kuò)增得到SAG2基因的開放閱讀框序列。反應(yīng)程序：①RT：30℃5min；42℃30 min；5℃ 5min。②PCR：95℃ 5min；94℃30s，58℃1min，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR結(jié)束后，10g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察SAG2擴(kuò)增結(jié)果，產(chǎn)物用DNA片段純化回收試劑盒回收，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 pMD18-T-SAG2載體的構(gòu)建 將上述PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，16℃連接過夜，構(gòu)建pMD18-T-SAG2，轉(zhuǎn)化入E.coli（DH5α）感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR鑒定篩選陽性克隆菌株，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。

1.2.3 重組整合載體pMV361-SAG2的構(gòu)建 用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-SAG2和pMV361，分別回收SAG2目的片段和pMV361載體大片段，將目的片段和載體大片段進(jìn)行連接，16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒。分別用PCR和雙酶切的方法進(jìn)行鑒定，構(gòu)建整合表達(dá)載體pMV361-SAG2。

1.2.4 電穿孔轉(zhuǎn)染BCG 將BCG接種于MB7H9液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期（3周～4周），OD 600nm≈0.5，離心收集菌體，沉淀用100 mL／L甘油洗滌，最后重懸于1mL 100mL／L甘油中，置-80℃保存?zhèn)溆?。?0μL～100μL菌液加入0.1μg質(zhì)粒DNA置于電極杯中，按照1.8KV，25μF，100Ω進(jìn)行電擊，轉(zhuǎn)染后立即加入MB7H9液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2d后涂布于含20μg／mL卡那霉素的MB7H9培養(yǎng)基平板中，用封口膜密封培養(yǎng)皿，21d后選取陽性菌落。

1.2.5 重組質(zhì)粒pMV361-SAG2在卡介苗中的表達(dá) 挑取卡那霉素抗性平板上的菌落接種到MB7H9液體培養(yǎng)基中，加入卡那霉素至終濃度為20μg／mL，于37℃培養(yǎng)。當(dāng) OD 600nm 為0.5～0.8時(shí)（約20d～25d），將含有外源基因的重組卡介苗置于45℃水浴2h～3h，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 離心收集菌體和上清液，菌體加入分支桿菌裂解緩沖液以重選沉淀，并加入終濃度為10g／L的SDS，終濃度為100 μg／mL的溶菌酶，37℃作用15min，超聲裂解溶液至不再黏稠，加等量的2×SDS加樣緩沖液，100℃煮沸10min，加入預(yù)先灌制的SDS聚丙烯酰胺凝膠中，每孔的上樣量為15μL，70V～120V電泳。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色并觀察結(jié)果。

1.2.7 表達(dá)產(chǎn)物Western blot分析 按上述方法，將重組卡介苗pMV361-SAG2，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。將面積大小與凝膠相同的6張Whatman濾紙和1張硝酸纖維素膜，預(yù)先浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中10min。電泳完后取出凝膠，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡，組裝轉(zhuǎn)移夾層。從陽極到陰極順次放置3層濾紙、硝酸纖維素膜、凝膠、3層濾紙，小心排出氣泡，對齊并加緊，置于支架內(nèi)。加轉(zhuǎn)移緩沖液，以250mA電泳1h，取出轉(zhuǎn)移膜，并標(biāo)記。用2g／L麗春紅染色液快速顯色，觀察轉(zhuǎn)印效果，用封閉液進(jìn)行封閉，洗滌3次后，用自制柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）多克隆抗體對封閉液按1∶500稀釋，37℃孵育轉(zhuǎn)印膜2h，洗滌3次，加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗，孵育1h，洗滌后用DAB顯色試劑盒進(jìn)行避光顯色，當(dāng)出現(xiàn)清晰的目的條帶時(shí)，立即水洗并照相保存。

2 結(jié)果

2.1 SAG2基因的RT-PCR擴(kuò)增和pMD18-TSAG2克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，柔嫩艾美耳球蟲SAG2基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中均出現(xiàn)大小為813bp的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。將SAG2基因的RT-PCR產(chǎn)物克隆至PMD18-T載體后轉(zhuǎn)化E.coli（DH5α），挑取陽性克隆株提取克隆質(zhì)粒，出現(xiàn)大小為3 506bp的條帶，與預(yù)期大小一致（圖2）。

圖1 SAG2基因RT-PCR產(chǎn)物電泳Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR products of SAG2gene

2.2 重組質(zhì)粒pMV361-SAG2的鑒定

酶切鑒定：挑選陽性克隆菌落，提取質(zhì)粒，分別用HindⅢ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳，在813bp處見到明顯目的條帶（圖3）。

PCR鑒定：以篩選的陽性克隆菌落為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在813bp處出現(xiàn)清晰的陽性擴(kuò)增帶（圖3）。

圖2 pMD18-T-SAG2質(zhì)粒電泳Fig.2 Electrophoresis of pMD18-T-SAG2plasmid

圖3 PCR和雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pMV361-SAG2Fig.3 Identification of pMV361-SAG2plasmid by PCR and double restriction enzyme digestion

2.3 SAG2基因核苷酸序列測定

經(jīng)DNA Star軟件分析，測序結(jié)果與原序列同源性為100%，與本實(shí)驗(yàn)室研究人員先前測定的SAG2核苷酸序列完全相同。表明成功獲得重組質(zhì)粒pMV361-SAG2。

2.4 柔嫩艾美耳球蟲SAG2基因在卡介苗中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將重組卡介苗菌液45℃誘導(dǎo)2h后，120g／L SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，在約28ku處出現(xiàn)目的蛋白帶，與預(yù)期蛋白分子質(zhì)量相符（圖4）。

圖4 柔嫩艾美耳球蟲SAG2基因在卡介苗中表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.4 Analysis of products of E.tenella SAG2 expressed in BCG by SDS-PAGE

2.5 柔嫩艾美耳球蟲SAG2基因在卡介苗中表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析

Western blot結(jié)果顯示，重組卡介苗pMV361-SAG2表達(dá)產(chǎn)物可被抗柔嫩艾美耳球蟲的多克隆抗體識別，產(chǎn)生特異性條帶，而對照組則無此反應(yīng)（圖5）。證實(shí)SAG2在卡介苗中的得到了正確的表達(dá)。

圖5 柔嫩艾美耳球蟲SAG2基因在卡介苗中表達(dá)產(chǎn)物 Western blot分析Fig.5 Analysis of products of E.tenella SAG2 expressed in BCG by Western bolt

3 討論

柔嫩艾美耳球蟲的子孢子和裂殖子表面抗原在球蟲識別、黏附和侵入宿主細(xì)胞等的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有報(bào)道克隆表達(dá)了E.tenella表面抗原SAG5、SAG10基因，二者均在子孢子入侵和裂殖子生殖階段有表達(dá)，并證明了重組蛋白均具有一定的抗球蟲感染保護(hù)力［14］。目前已克隆表達(dá)了許多具有免疫原性的球蟲表面抗原，例如，雞柔嫩艾美耳球蟲5401基因在大腸埃希菌中成功表達(dá)［15］，柔嫩艾美耳球蟲MZ5-7基因在真核表達(dá)載體中表達(dá)［16］以及柔嫩艾美耳球蟲EtIMP12基因的重組表達(dá)等［17］，且都表現(xiàn)出一定的免疫效果。然而，柔嫩艾美耳球蟲SAG2抗原是柔嫩艾美耳球蟲在第二裂殖子階段進(jìn)行表達(dá)的表面抗原，且具有良好的免疫原性。因此，SAG2抗原也是與蟲體對宿主的識別、黏附和侵入相關(guān)抗原之一。

卡介苗是由減毒牛分支桿菌懸液制成的活菌苗，能夠有效地誘導(dǎo)病毒、細(xì)菌、寄生蟲等抗原的獲得性免疫應(yīng)答。由卡介苗表達(dá)的蛋白不需要純化，而且其本身作為免疫增強(qiáng)劑，能激活機(jī)體免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生，從而引起T細(xì)胞免疫反應(yīng)來提高機(jī)體的免疫力。卡介苗由于其較好的免疫效果，以及毒副作用小、安全性高、生產(chǎn)成本低廉等特點(diǎn)，已被廣泛的應(yīng)用。在抗寄生蟲感染方面，已經(jīng)構(gòu)建了血吸蟲［18-19］、肝片吸蟲［20］、瘧原蟲［21-22］、利什曼原蟲［23］和弓形蟲［24-26］等抗原的重組卡介苗，對機(jī)體均有不同程度的免疫保護(hù)力。利用卡介苗研制抗球蟲疫苗，也越來越受到人們的關(guān)注，已報(bào)道運(yùn)用卡介苗來表達(dá)柔嫩艾美耳球蟲Rhomboid基因［27］和巨型艾美耳球蟲AMA1抗原［28］，均顯示出一定的免疫保護(hù)效果，但未見有利用卡介苗來表達(dá)柔嫩艾美耳球蟲主要表面抗原蛋白的報(bào)道。由于雞球蟲主要寄生于雞的盲腸和直腸黏膜內(nèi)，細(xì)胞免疫在機(jī)體抗球蟲免疫中起主要作用，因此，利用卡介苗來研制抗球蟲疫苗具有潛在的研究價(jià)值。

本研究利用卡介苗來表達(dá)柔嫩艾美耳球蟲主要表面抗原蛋白SAG2，構(gòu)建整合表達(dá)載體pMV361-SAG2，并轉(zhuǎn)入卡介苗進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)建的重組卡介苗熱穩(wěn)定性強(qiáng)，易于生產(chǎn)，為下一步研究疫苗的免疫保護(hù)性奠定基礎(chǔ)。

［1］Williams R B.A compartmentalised model for the estimation of the cost of coccidiosis to the world＇s chicken production industry［J］.Int J Parasitol，1999，29（8）：1209-1229.

［2］Sangster N，Batterham P，Chapman H D，et al.Resistance to antiparasitic drugs：the role of molecular diagnosis［J］.Int J Parasitol，2002，32（5）：637-653.

［3］Allen P C，F(xiàn)etterer R H.Recent advances in biology and immunobiology ofEimeriaspecies and in diagnosis and control of infection with these coccidian parasites of poultry ［J］.Clin Microbiol Rev，2002，15（1）：58-65.

［4］Bangoura B，Alnassan A A，Lendner M，et al.Efficacy of an anticoccidial live vaccine in prevention of necrotic enteritis in chickens［J］.Exp Parasitol，2014，145：125-134.

［5］Fetterer R H，Jenkins M C，Miska K B，et al.Evaluation of an experimental irradiated oocyst vaccine to protect broiler chicks against avian coccidiosis［J］.Avian Dis，2014，58（3）：391-397.

［6］Chapman H D，Cherry T E，Danforth H D，et al.Sustainable coccidiosis control in poultry production：the role of live vaccines［J］.Int J Parasitol，2002，32（5）：617-629.

［7］Shirley M W，蔡建平，謝明權(quán).雞球蟲病的免疫控制技術(shù)［J］.中國家禽，2003，25（7）：33-35.

［8］Sathish K，Sriraman R，Subramanian B M，et al.Plant expressed EtMIC2is an effective immunogen in conferring protection against chicken coccidiosis ［J］.Vaccine，2011，29（49）：9201-9208.

［9］樓士林，章 軍，吳巧娟，等.藍(lán)藻基因表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001（2）：586-591.

［10］Zhang J，Chen P，Sun H，et al.Pichiapastorisexpressed Et-Mic2protein as a potential vaccine against chicken coccidiosis［J］.Vet Parasitol，2014，205（1-2）：62-69.

［11］Delogu G，Brennan M J.Comparative antigens ofMycobacteriumtuberculosisimmune response to PE and PE PGRS［J］.Infect Immun，2001，69（9）：5606-5611.

［12］Lillehoj H S.Role of T lymphocytes and cytokines in coccidiosis［J］.Int J Parasitol，1998，28（7）：1071-1081.

［13］曹利利，姚新華，侯洪烈，等.柔嫩艾美耳球蟲長春株SAG2基因的克隆與序列分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（12）：1-5.

［14］麥 博.雞柔嫩艾美耳球蟲表面抗原SAG5和SAG10基因的克隆與表達(dá)及免疫保護(hù)性試驗(yàn)［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

［15］杜愛芳，王素華，索 勛.雞柔嫩艾美耳球蟲ZJ株5401基因在大腸桿菌中的表達(dá) ［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（2）：187-190.

［16］Geriletu，Xu L，Xu R H，et al.Vaccination of chickens with DNA vaccine expressingEimeriatenellaMZ5-7against coccidiosis［J］.Vet Parasitol，2011，177（1-2）：6-12.

［17］Yin G，Lin Q，Wei W，et al.Protective immunity againstEimeriatenellainfection in chickens induced by immunization with a recombinant C-terminal derivative of EtIMP1［J］.Vet Immunol Immunopathol，2014，162（3-4）：117-121.

［18］Varaldo P B，Leite L C，Dias W O，et al.RecombinantMycobacteriumbovisBCG expressing the SmL4antigen ofSchistosomamansoniprotects mice from cercarial challenge ［J］.Infect Immun，2004，72（6）：3336-3343.

［19］李文桂，石佑恩，汪燕鳴，等.血吸蟲重組BCG-Sj26GST疫苗接種后保護(hù)力的觀察［J］.同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，24（1）：13-16.

［20］周 宇，張文露，黎萬奎，等.肝片吸蟲保護(hù)性抗原基因在卡介苗中的表達(dá)［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào) ：自然科學(xué)版，2003，40（2）：356-360.

［21］Zheng C，Xie P，Chen Y.Molecular cloning and sequencing of the circum sporozoite protein gene fromPlasmodiumfalciparumstrain FCC-1／HN and expression of the gene in Mycobacteria［J］.J Clin Microbiol，2001，39（8）：2911-2915.

［22］Mohamad D，Suppian R，Mohd Nor N.Immunomodulatory effects of recombinant BCG expressing MSP-1CofPlasmodiumfalciparumon LPS-or LPS＋I(xiàn)FN-γ-stimulated J774A.1 cells［J］.Hum Vac Immunother，2014，10（7）：1880-1886.

［23］Nahrevanian H，Jafary S P，Nemati S，et al.Evaluation of antileishmanial effects of killedLeishmaniavaccine with BCG adjuvant in Balb／c mice infected withLeishmaniamajorMRHO／IR／75／ER ［J］.Folia Parasitol（Praha），2013，60（1）：1-6.

［24］Yu Q，Huang X，Gong P，et al.Protective immunity induced by a recombinant BCG vaccine encoding the cyclophilin gene ofToxoplasmagondii［J］.Vaccine，2013，31（51）：6065-6071.

［25］Wang H，Liu Q，Liu K，et al.Immune response induced by recombinantMycobacteriumbovisBCG expressing ROP2gene ofToxoplasmagondii［J］.Parasitol Int，2007，56（4）：263-268.

［26］Supply P，Sutton P，Coughlan S N，et al.Immunogenicity of recombinant BCG producing the GRA1antigen fromToxoplasmagondii［J］.Vaccine，1999，17（7-8）：705-714.

［27］Wang Q，Chen L，Li J，et al.A novel recombinant BCG vaccine encodingEimeriatenellarhomboid and chicken IL-2induces protective immunity against coccidiosis［J］.Korean J Parasitol，2014，52（3）：251-256.

［28］Li W C，Zhang X K，Du L，et al.Eimeriamaxima：efficacy of recombinantMycobacteriumbovisBCG expressing apical membrane antigen1against homologous infection［J］.Parasitol Res，2013，112（11）：3825-3833.