許 晗，李海敏，王愛玲，李春燕，李河林，呂其壯，張彥明，郭抗抗

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒［1］。PCV-2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropaphy syndrome，PDNS）、仔豬先天性震顫（Congenital tremors，CT）及豬呼吸道疾?。≒orcine respiratory disease complex，PRDC）等的主要致病因素［2-3］，其感染呈全球性分布，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病原。國內(nèi)豬場PCV-2的感染情況比較嚴重，往往與其他病原混合感染，最常見的是與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）等混合感染。為了預(yù)防PCV-2相關(guān)疾病的發(fā)生，減少養(yǎng)豬業(yè)的損失，對繁殖母豬和仔豬進行PCV-2疫苗免疫是目前生產(chǎn)中采用的主要措施。近10年來，多種PCV-2商品疫苗推向市場，如法國梅里亞公司研制的全病毒滅活苗“Circovac”，德國勃林格公司研制的亞單位疫苗“Ingelvac CircoFLEX”，均對繁殖母豬和仔豬具有良好的保護效果［4］。國內(nèi)也有多家獸用生物制品相關(guān)企業(yè)都有PCV-2滅活疫苗上市銷售。這些PCV-2疫苗都能夠激發(fā)動物的免疫反應(yīng)，有效地降低PCV-2對豬的感染，保護動物的免疫系統(tǒng)。雖然如此，但目前PCV-2依然在豬場存在，甚至流行［5］。因此，研究一種抗原濃度高、安全性好的新型豬圓環(huán)病毒疫苗成為現(xiàn)實需要。

基因工程疫苗較之滅活疫苗和弱毒疫苗，具有安全性好，穩(wěn)定性強，可區(qū)分免疫動物和自然感染動物，易制成多價聯(lián)苗等優(yōu)點。本研究采用重組腺病毒表達系統(tǒng)，構(gòu)建了表達PCV-2Cap基因和具有免疫增強作用的耶爾森菌侵襲素C端（InvC）基因的重組腺病毒，為新型豬圓環(huán)病毒疫苗的研發(fā)提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和細胞 腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pAd-Shttle-CMV，帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的骨架載體pAdEasy-1、插入PCV-2全基因序列的重組質(zhì)粒TPCV-2、HEK293AD細胞、E.coli菌株 DH5α均由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生學(xué)實驗室提供；pAd-（Gly4Ser）3-InvC由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院杜恩歧副教授饋贈。

1.1.2 主要試劑 高保真 Prime STAR HSTaq、BglⅡ、SalⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，Trizol試劑，TaKaRa公司產(chǎn)品；PacⅠ，NEB公司產(chǎn)品；PmeⅠ內(nèi)切酶，TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，Thermo公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒，核酸膠回收試劑盒，百泰克公司產(chǎn)品；胎牛血清，BioWest公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，Hyclone公司產(chǎn)品；Dylight594山羊抗兔抗體，晶彩生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的PCV-2Cap基因序列（KM924367.1）以及（Gly4Ser）3-InvC序列（HE805230.1）（InvC）設(shè)計引物，由北京華大基因公司合成。引物序列為：Cap上游引物P1：5′-GAAGATCTATGACGTATCCAAGGAGGCG-3′，劃線部分為BglⅡ酶切位點；Cap下游引物P2：5′-ACGCGTCGACTTAAGGGTTAAGTGG-3′，劃線部分為SalⅠ酶切位點；PCR產(chǎn)物大小為702bp。InvC（664bp）上游引物 P3：5′-ACGCGTCGACGGATCCGGATCAGGTTCAG-3′，劃線部分為SalⅠ酶切位點；InvC下游引物P4：5′-CCCAAGCTTCTATATTGCCAGCGCACAG-3′，劃線部分為HindⅢ酶切位點；PCR產(chǎn)物大小為664bp。圖1示例2個目的基因與酶切位點之間的關(guān)系。

圖1 目的基因與酶切位點位置關(guān)系Fig.1 The position relation between two target genes and three restriction sites

1.2.2 目的基因擴增 以插入PCV-2全基因序列的重組質(zhì)粒 T-PCV-2，pAd-（Gly4Ser）3-InvC 為模板，分別用P1、P2，P3、P4引物，擴增獲得Cap基因和InvC基因。PCR反應(yīng)體系為50μL，包括5×Primes TAR buffer 10 μL，上、下 游 引 物（10μmol／L）各2.5μL，模板10μL，prime STAR HS DNA Polymerase 0.5μL，滅菌水 20.5μL。PCR反應(yīng)條件：98℃ 5min；98℃ 30s，60℃15s，72℃50s，共35個循環(huán)；72℃10min。Cap和InvC基因PCR產(chǎn)物均經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收。

1.2.3 重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建 將Cap基因先連接于載體pAdShuttle-CMV，連接成功后再將InvC基因連接于pAdShuttle-CMV-Cap，獲得穿梭質(zhì)粒pAdShuttle-CMV-Cap-InvC。步驟為：首先將Cap基因和腺病毒穿梭載體pAdShuttle分別用BglⅡ和SalⅠ進行雙酶切，回收產(chǎn)物，按說明書用T4連接酶將雙酶切產(chǎn)物4℃過夜連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞，LB培養(yǎng)液37℃、190r／min搖菌60min，4 000r／min、離心5min，棄去大部分培養(yǎng)液，剩余100μL LB培養(yǎng)液吹懸菌泥，涂布于含有50μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)板上，37℃16h，挑出15個～20個單個菌落培養(yǎng)，PCR、BglⅡ和SalⅠ雙酶切鑒定含有Cap基因的重組質(zhì)粒。取陽性質(zhì)粒與InvC基因用SalⅠ和HindⅢ雙酶切，按前述操作，將InvC連入載體，獲得經(jīng)SalⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定有InvC基因的重組質(zhì)粒。陽性質(zhì)粒送至華大基因公司測序。

1.2.4 同源重組腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定 用PmeI酶對pAdShuttle-CMV-Cap-InvC線性化酶切，CaCl2法轉(zhuǎn)化入BJ5183感受態(tài)細胞（含pAdEasy骨架質(zhì)粒），冰浴30min，LB培養(yǎng)液37℃、170r／min搖菌90min，離心后取菌泥涂布于含有50μg／mL卡那霉素的LB培養(yǎng)板上，37℃20h，挑取單個菌落LB培養(yǎng)液37℃、170r／min搖菌14h，提取質(zhì)粒，8g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒大小，挑選約30kb大小的陽性質(zhì)粒再通過PacⅠ酶切鑒定，鑒定正確后命名pAd-Cap-InvC。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細胞培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，菌液和質(zhì)粒均保存于-20℃?zhèn)溆?。同時構(gòu)建僅插入目的基因片段Cap的pAd-Cap，未插入任何目的基因的pAd作為試驗對照，同步進行后續(xù)試驗。

1.2.5 重組腺病毒的包裝 將PacⅠ酶切線性化的重組質(zhì)粒用TubofectTM轉(zhuǎn)染試劑按說明書轉(zhuǎn)染HEK293細胞，待轉(zhuǎn)染后7d～10d細胞明顯病變，收集培養(yǎng)液和細胞，反復(fù)凍融3次，4℃、11 000r／min離心12min，收集上清液作為病毒液，繼續(xù)感染HEK293細胞24h～48h至出現(xiàn)細胞病變，同時能在熒光顯微鏡下觀察到pAd-Easy-1載體綠色熒光蛋白基因表達的綠色熒光，收集培養(yǎng)液和細胞，按上述方法收集保存上清液，獲得的重組腺病毒命名為rAd-Cap-InvC。

1.2.6 重組腺病毒的鑒定

1.2.6.1 重組腺病毒基因組鑒定 取適量第1代的重組腺病毒，按照病毒DNA基因提取試劑盒說明書，提取重組腺病毒DNA基因組，以此為模板，用P1／P2，P3／P4兩對引物擴增檢測目的基因Cap和InvC。

1.2.6.2 重組腺病毒目的穩(wěn)定性檢測 取適量第3、7、12代的重組腺病毒（rAd-Cap-InvC），依照 Trizol試劑說明書提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：模板 RNA 4.0μL，Oligo（dT）（50mol／L）1.0μL，RNase free dH2O 1.0μL，充分混勻，70 ℃10min，冰浴3min，加入5×M-mLV buffer 2.0 μL；dNTP（10mmol／L）0.5μL；Rnase inhibitor 0.25μL；反轉(zhuǎn)錄酶（200U／μL）0.25μL，RNase free dH2O定容至10μL。42℃1h，70℃15min，冰上冷卻10min。分別以P1／P2，P3／P4，按照前述條件進行PCR反應(yīng)。

1.2.6.3 重組腺病毒目的蛋白表達的鑒定 將重組腺病毒反復(fù)凍融3次，4℃、11 000r／min離心10 min，收集上清。取30μL病毒液，加入2×SDSPAGE上樣緩沖液，充分混勻后冰浴30min，煮沸10min，離心后吸取上清，以1∶1 000稀釋的兔抗PCV-2血清為一抗，以1∶500稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記鼠抗兔血清為二抗，以DAB為顯色劑，Western blot鑒定目的蛋白。

1.2.6.4 重組腺病毒間接免疫熒光鑒定 將重組腺病毒稀釋至合適濃度，接種于96孔板里的單層HEK293細胞，體積分數(shù)為5%的CO2、37℃培養(yǎng)36h～42h，棄上清，PBS清洗3次，加入甲醇和丙酮1∶1混合液，-20℃固定20min，PBS洗3次，50 g／L脫脂奶粉37℃封閉2h，以1∶50稀釋的兔抗PCV-2血清作為一抗、以1∶100稀釋的Dylight594山羊抗兔抗體為二抗孵育，清洗晾干，加維持液，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7 重組腺病毒的純化和TCID50的測定 將第一代rAd-Cap-InvC用DMEM培養(yǎng)基做8個梯度稀釋（10-1至10-8），各取1mL稀釋好的病毒液添加到生長良好的HEK293細胞，置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱、37℃孵育2h，棄去上清，每孔覆蓋2 mL含有10g／L低熔點瓊脂糖的無酚紅培養(yǎng)基，封口，倒置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱、37℃恒溫靜置培養(yǎng)3d～8d，每天統(tǒng)計噬斑的數(shù)量直至數(shù)量不再變化。挑取單個噬斑瓊脂糖塊，置于1.5mL離心管中并加入500μL無菌PBS，瓊脂搗碎反復(fù)凍融3次，12 000r／min離心10min，收獲上清病毒液接種于HEK293細胞，如此反復(fù)純化3次。將純化好的病毒連續(xù)接入HEK293細胞進行傳代，待傳至第12代，將重組病毒10倍梯度稀釋，由10-3至10-13依次接種于96孔板的HEK293細胞，并設(shè)立陰性對照，每個稀釋度做8個復(fù)孔，每孔100μL體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中、37℃培養(yǎng)5d，按照Reed-Muench法，計算病毒TCID50。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆

用引物P1，P2經(jīng)PCR擴增得到702bp的Cap基因片段（圖2）；用引物P3、P4經(jīng)PCR擴增得到664bp的InvC基因片段（圖3）。

2.2 重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建

將構(gòu)建的pAdShuttle-CMV-Cap-InvC分別用BglⅡ和SalⅠ，SalⅠ和HindⅢ，BglⅡ和HindⅢ做3三組雙酶切鑒定，分別得到約702、664、1 370bp的條帶（圖4）。證明Cap和InvC均成功克隆至穿梭載體。

圖2 Cap基因的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of Cap gene

圖3 InvC基因的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of InvC gene

圖4 穿梭載體pAdShuttle-CMV-Cap-InvC酶切鑒定Fig.4 Identification of pAdShuttle-CMV-Cap-InvC with enzyme digestion

2.3 重組腺病毒骨架載體的構(gòu)建

將同源重組獲得的pAd-Cap-InvC，獲得的pAd-Cap和pAd用PacⅠ酶切鑒定，3個同源重組質(zhì)粒約30kb，酶切得到大小約4 800bp條帶（圖5），鑒定結(jié)果顯示，獲得了重組腺病毒載體。

2.4 重組腺病毒的獲得

用構(gòu)建的重組腺病毒骨架轉(zhuǎn)染HEK293細胞，8d～10d后顯微鏡下見到明顯的細胞變形、聚縮、脫落等變化，熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光細胞。收集病變細胞和培養(yǎng)液，反復(fù)凍融接入新的HEK293細胞，24h后細胞可觀察到綠色熒光，細胞變形、聚縮、脫落等變化（圖6）。

2.5 重組腺病毒中目的基因檢測

提取第2代重組腺病毒DNA作為模板PCR，從rAd-Cap-InvC擴增出目的基因Cap（圖7）和InvC（圖8），rAd-Cap中僅擴增出目的基因Cap條帶（圖7），rAd沒有擴增出任何目的基因。

圖5 pAd-Cap-InvC，pAd-Cap和pAd的PacⅠ酶切鑒定Fig.5 Identification of pAd-Cap-InvC，pAd-Cap and pAd by enzyme digestion with PacⅠ

圖6 重組腺病毒感染HEK293細胞后的變化Fig.6 The changes of HEK293cells infected with rAd-Cap-InvC

2.6 重組腺病毒rAd-Cap-InvC目的基因穩(wěn)定性檢測

提取第3、7、12代重組腺病毒rAd-Cap-InvC的RNA，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，3個代次的rAd-Cap-InvC均擴增得到702bp的Cap（圖9）和664bp的InvC基因（圖10）。結(jié)果表明，該重組腺病毒的基因穩(wěn)定性良好，經(jīng)過多次傳代，Cap與InvC基因都沒有出現(xiàn)缺失。

2.7 Western blot檢測目的蛋白的表達

從分別接入重組腺病毒細胞rAd-Cap-InvC，rAd-Cap和rAd的細胞中提取的蛋白進行Western blot，可見rAd-Cap-InvC在約50ku處有一條印跡條帶，說明Cap-InvC融合蛋白得到表達，rAd-Cap在約26ku處有一條印跡條帶，說明Cap蛋白得到表達（圖11）。

圖7 重組病毒rAd-Cap-InvC和rAd-Cap中Cap基因的PCR擴增Fig.7 PCR amplification of Cap in rAd-Cap-InvC and rAd-Cap

圖8 重組病毒rAd-Cap-InvC中InvC基因的PCR擴增Fig.8 PCR amplification of InvC gene in rAd-Cap-InvC

圖9 不同代次的rAd-Cap-InvC Cap基因的PCR擴增Fig.9 PCR amplification of Cap gene from different generations of rAd-Cap-InvC

2.8 間接免疫熒光鑒定

接種rAd-Cap-InvC和rAd-Cap 2種重組腺病毒的HEK293細胞均能觀察到Cap蛋白特異紅色熒光，而接種rAd細胞的以及正常細胞則觀察不到紅色熒光（圖12）。

圖10 不同代次的rAd-Cap-InvC中InvC基因的PCR擴增Fig.10 PCR amplification of InvC gene from different generations of rAd-Cap-InvC

圖11 蛋白質(zhì)表達的Western blot檢測Fig.11 Detection of protein expression by Western blot

圖12 重組腺病毒中Cap蛋白的免疫熒光檢測Fig.12 Detection of Cap with IFA in HEK293cells infected with recombinant adenovirus

2.9 重組腺病毒的純化和滴度檢測

經(jīng)瓊脂糖噬斑純化獲得純化后的病毒傳至12代，測得重組腺病毒rAd-Cap-InvC的TCID50為10-9.32／mL。

3 討論

近年來國際國內(nèi)有多種PCV-2商品疫苗上市，市售PCV-2商品疫苗對控制PCV-2的感染具有較好的效果，但PCV-2的流行依然存在。上市的疫苗大多為滅活苗，其滅活病毒難以純化，制備成本較高，使用時需要多次注射，并且易導(dǎo)致疫苗受體動物的過敏反應(yīng)。DNA疫苗正處在研制階段，雖然已取得一定進展［6］，但其遺傳安全性也受到爭議。這些問題的存在，提示PCV-2疫苗的研究工作還有待深入。通過基因工程手段獲得病毒活載體疫苗，不失為一種嶄新的方向。Cap蛋白作為PCV-2的免疫原性蛋白是基因工程疫苗重組抗原蛋白的首選。2001年，Liu Q等［7］就利用大腸埃希菌表達出具有特異性的重組Cap蛋白，表達量占大腸埃希菌表達蛋白總量的1%。Wang K等［8］使用乳酸菌表達重組Cap蛋白，經(jīng)口免疫小鼠，ELISA檢測到血清中PCV-2特異性抗體。Bucarey Sergio A 等［9］利用大腸埃希菌／酵母菌表達Cap蛋白，對小鼠具有良好的免疫原性。

腺病毒宿主范圍廣，能夠感染多數(shù)哺乳動物細胞，表達病毒自身基因，但并不整合到染色體，不會導(dǎo)致插入性突變。腺病毒增殖能力強，其滴度能達到1011VP／mL。腺病毒載體能夠攜帶多種抗原，并刺激機體產(chǎn)生很強的體液免疫或細胞免疫。由于腺病毒載體能感染呼吸道和腸道細胞，可以方便地通過黏膜進行免疫并誘導(dǎo)機體產(chǎn)生黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，腺病毒載體還可以同其他載體聯(lián)合免疫［10］。因此腺病毒載體疫苗廣泛應(yīng)用于細菌、病毒、寄生蟲及腫瘤疫苗方面的研究［11］。Wang X W 等［12］構(gòu)建了表達重組Cap蛋白的腺病毒，經(jīng)過2次免疫，小鼠的特異性抗體和中和抗體均能達到較高的水平。Liu G M等［13］構(gòu)建了表達Cap-INFγ融合蛋白的重組腺病毒，免疫效果明顯好于單純表達Cap蛋白的重組腺病毒。雖然PCV-2活載體疫苗具有優(yōu)越的前景，但相關(guān)的研究工作依舊任重而道遠。

假結(jié)核耶爾森菌侵襲素（Inv）蛋白是一種外膜蛋白，由耶爾森菌侵襲素基因編碼986個氨基酸［14］。該蛋白普遍存在于革蘭陰性菌外膜，通過結(jié)合細胞的β-1整合素介導(dǎo)細菌對靶細胞的識別，并誘導(dǎo)細胞促炎性細胞因子的表達［15］。Inv蛋白在結(jié)合β-1整合素后誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生活性氧并釋放到胞外環(huán)境，同時活化磷酸肌醇3-激酶信號通路，吸引中性粒細胞聚集［16］。Inv蛋白還能激活黏著斑復(fù)合體，Rac1，絲裂原活化蛋白激酶，以及NFκB等信號通路級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)CD4和CD8T細胞應(yīng)答，表明Inv蛋白能夠有效地增強宿主細胞對抗原的攝取能力，進一步提高動物機體的細胞免疫和體液免疫，具備成為一種嶄新的疫苗佐劑的巨大潛力［17］。有人利用這一特性，將無致病性志賀氏菌和大腸埃希菌通過Inv蛋白與腸道中的M細胞β-1整合素結(jié)合，靶向遞送抗原給腸淋巴組織進行免疫［18］。

構(gòu)建表達Cap-InvC融合蛋白的重組腺病毒，作為疫苗的免疫原，既具有腺病毒滴度高，穩(wěn)定表達大量特異抗原蛋白，對宿主機體安全性高等腺病毒載體優(yōu)點，又具備通過多種途徑誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高效的體液免疫和細胞免疫等侵襲素蛋白的優(yōu)勢，是在PCV-2活載體疫苗上的一次嘗試。

本研究以PCV-2Cap和InvC基因作為目的基因，利用重組腺病毒表達系統(tǒng)，成功構(gòu)建表達Cap-InvC融合蛋白的重組腺病毒（rAd-Cap-InvC）。通過PCR、RT-PCR、Western blot、IFA 驗證該重組腺病毒有效表達了目的蛋白。為了評價rAd-Cap-InvC對動物的免疫性和保護性水平，我們將繼續(xù)進行動物免疫試驗，為PCV-2基因工程活載體疫苗的研究提供基礎(chǔ)材料。

［1］Yu S，Opriessnig T，Kitikoon P，et al.Porcine circovirus type 2（PCV-2）distribution and replication in tissues and immune cells in early infected pigs［J］.Vet Immunol Immunopathol，2007，115（3-4）：261-272.

［2］周繼勇，陳慶新，葉菊秀，等.豬圓環(huán)病毒2型感染的血清學(xué)分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2004，24（1）：1-7.

［3］Shibahara T，Sato K，Ishikawa Y，et al.Porcine circovirus induces B lymphocyte depletion in pigs with wasting disease syndrome［J］.J Vet Med Sci，2000，62（11）：1125-1131.

［4］Kurmann J，Sydler T，Brugnera E，et al.Vaccination of dams increases antibody titer and improves growth parameters in finisher pigs subclinically infected with porcine circobirus type2［J］.Clin Vac Immunol，2011，18（10）：1644-1649.

［5］李 玲，李國新，周艷君，等.2008～2011年中國部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型的分子流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國動物傳染病學(xué)報，2012，20（2）：1-10.

［6］Chen G L，F(xiàn)u P F，Wang L Q，et al.Immune responses of piglets immunized by a recombinant plasmid containing porcine circovirus type 2and porcine interleukin-18genes［J］.Viral Immunol，2014，27（10）：521-528.

［7］Liu Q，Willson P，Attoh-Poku S，et al.Bacterial expression of an immunologically reactive PCV-2ORF2fusion protein［J］.Protein Express Purificat，2001，21（1）：115-120.

［8］Wang K，Huang L，Kong J，et al.Expression of the capsid protein of porcine circovirus type 2inLactococcuslactisfor oral vaccinationJ .J Virol Meth200815020081-6.

［9］Bucarey S A，Noriega J，Reyes P，et al.The optimized capsid gene of porcine circovirus type 2expressed in yeast forms virus-like particles and elicits antibody responses in mice fed with recombinant yeast extracts［J］.Vaccine，2009，27（42）：5781-5790.

［10］Majhen D，Calderon H，Chandra N，et al.Adenovirus-based vaccines for fighting infectious diseases and cancer：progress in the field［J］.Human Gene Ther，2014，25（4）：301-317.

［11］Dong D，Gao J，Sun Y，et al.Adenovirus-mediated co-expression of the TRAIL and HN genes inhibits growth and induces apoptosis in Marek＇s disease tumor cell line MSB-1［J］.Cancer Cell Int，2015，15：20.

［12］Wang X W，Jiang W M，Jiang P，et al.Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus 2（PCV-2）in mice［J］.Vaccine，2006，24（16）：3374-3380.

［13］Liu G M，Luo M L，Chen R A，et al.Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing ORF2of PCV-2and porcine IFN gammaJ .Vaccine20112947 8677-8682.

［14］Anderson J C，Clarke E J，Arkin A P，et al.Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria［J］.J Mol Biol，2006，355（4）：619-627.

［15］Wong K W，Isberg R R.Emerging views on integrin signaling via Rac1during invasin-promoted bacterial uptake［J］.Curr Opin Microbiol，2005，8（1）：4-9.

［16］Schaake J，Drees A，Grüning P，et al.Essential role of invasin for colonization and persistence ofYersiniaenterocoliticain its natural reservoir host，the pig［J］.Infect Immun，2014，82（3）：960-969.

［17］Autenrieth S E，Autenrieth I B.Yersiniaenterocolitica：Subversion of adaptive immunity and implications for vaccine development［J］.Int J Med Microbiol，2008，298（1-2）：69-77.

［18］Critchley-Thorne R J，Stagg A J，Vassaux G.RecombinantEscherichiacoliexpressing invasin targets the Peyer＇s patches：the basis for a bacterial formulation for oral vaccination［J］.Mol Ther，2006，14（2）：183-191.