黎 江，尹 丹，劉洪麗，何 穎，胡庭?。?/p>

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧530005；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西南寧530001）

馬尾藻（Sargassum）是褐藻中的一類海藻，屬褐藻門，墨角菜目，馬尾藻科，是最大型的藻類，也是唯一能在開闊水域自主生長的藻類。馬尾藻盛產(chǎn)于我國廣東、廣西沿海，資源豐富，但尚未很好地開發(fā)利用。馬尾藻多糖（Sargassumpolysaccharide，SP）是從馬尾藻中分離提取出來的易溶于水、黏度較高的多糖復(fù)合物，在抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒及提高機(jī)體免疫力方面均有重要作用［1-3］。張玲等［4］研究表明，100mg／L～400mg／L的馬尾藻多糖能顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖，且400mg／L馬尾藻多糖能顯著增加氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽（reduced glutathione sodjum，GSH）含量。有研究表明，淋巴細(xì)胞表面存在多糖受體，多糖能通過與其受體結(jié)合啟動淋巴細(xì)胞信息傳遞［5］。論文通過觀察馬尾藻多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平的影響，探討其體外抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 馬尾藻多糖由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提取、分離、純化，還原糖含量為87.76%。

1.1.2 試驗(yàn)用動物 三黃雞，60日齡，臨床健康。1.1.3 試劑和儀器 RPMI-1640粉劑，Gibco公司產(chǎn)品；N-乙 基馬來酰亞胺（N-ethylmaleimide，NEM，Alfa Aesar）、GSH 標(biāo)準(zhǔn)品、氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲醛（O-phenaldehyde，OPT）和其他試劑均為國產(chǎn)分析純；RF-5301PC熒光分光光譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；高速冷凍臺式離心機(jī)、微量離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；臺式低速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；超聲波清洗器（KQ-250B），昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱（5500E），美國Nuaire公司產(chǎn)品；生物顯微鏡為YS100型，Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雞脾臟淋巴細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)［6］的方法，將雞頸靜脈放血處死，無菌條件下采其脾臟，用D-Hank＇s液洗去表面的血液，然后在加入適量D-Hank＇s液的培養(yǎng)皿中將脾臟輕輕研磨，再用200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，并將其加在等體積的雞淋巴細(xì)胞分離液中，2 000r／min離心10min，收集中間層的淋巴細(xì)胞，用D-Hank＇s液洗滌2次后加入適量完全RPMI-1640培養(yǎng)液，用臺盼藍(lán)拒染法測定培養(yǎng)液中活細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于95%才可用。調(diào)淋巴細(xì)胞濃度為4×106cells／mL。

1.2.2 試驗(yàn)分組及處理 試驗(yàn)分6個組，即對照組（只含淋巴細(xì)胞）和5個多糖組（馬尾藻多糖終濃度分別為12.5、25、50、100、200μg／mL），每孔培養(yǎng)體積為2mL，每組設(shè)4個平行。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及樣品收集 采用24孔培養(yǎng)板，每個時間段用1個培養(yǎng)板，共4個24孔培養(yǎng)板。置38℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中分別孵育4、8、12、24h，然后分別離心收集不同培養(yǎng)時間的脾臟淋巴細(xì)胞，加入50g／L三氯醋酸400μL，冰水浴超聲破碎1min，4℃、12 000r／min離心15min，取上清分裝于-80℃保存，備用。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)GSH水平測定 參考文獻(xiàn)［7］的方法，取裂解后的細(xì)胞上清液或GSH標(biāo)準(zhǔn)品200μL，加入3.6mL PBS-EDTA緩沖液（pH8.0）和200μL OPT，混勻，室溫孵育40min，于熒光分光光度計(jì)以激發(fā)波長350nm和發(fā)射波長425nm測定熒光值，按下列公式計(jì)算樣品中GSH含量：

GSH濃度（μmol／L）＝樣品管熒光讀數(shù)／標(biāo)準(zhǔn)品管熒光讀數(shù)×1 000／307.3

1.2.5 GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將各管內(nèi)液體混勻，室溫放置30min，以上操作均避光進(jìn)行。然后設(shè)定激發(fā)波長337.8nm，發(fā)射波長421.6nm，以“0”管作對照，測定各管熒光強(qiáng)度。以GSSG標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫軸（X），以對應(yīng)的熒光強(qiáng)度值為縱軸（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求直線回歸方程。將樣品管的熒光測定值代入方程，可求出待測樣品液中的GSSG含量。

表1 GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及操作方法Table 1 The standard curve of GSSG and manipulation mL

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)氧化性谷胱甘肽（GSSG）的測定 參照文獻(xiàn)［7］的方法，取裂解后的細(xì)胞上清液100μL，加入40μL N-乙基馬來酰亞胺（N-ethylmaleimide，NEM）（0.04mol／L）室溫孵育 30min，再加入1.9mL NaOH（0.1mol／L）和 100 μL OPT（1mg／mL），混勻，室溫孵育30min，以上操作均避光進(jìn)行。于熒光分光光度計(jì)以激發(fā)波長337.8nm和發(fā)射波長421.6nm測量熒光值。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算GSSG含量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用M±SD表示，數(shù)據(jù)用SPSS11.0for Windows分析。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 馬尾藻多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSH的影響

結(jié)果見表2。由表2可見，馬尾藻多糖與雞脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)4、8、12h均不同程度升高了細(xì)胞內(nèi)GSH含量，與空白對照組比較差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01），表明馬尾藻多糖能升高雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSH水平。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得到直線回歸方程：y＝2.845 5x＋0.118 7，R2＝0.996 2。

2.3 馬尾藻多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSSG的影響

結(jié)果見表3。由表3可見，各濃度馬尾藻多糖與雞脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)4、8、12h均不同程度降低細(xì)胞內(nèi)GSSG含量，與空白對照組比較，差異極顯著（P＜0.01），表明馬尾藻多糖能降低雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSSG水平。

圖1 GSSG標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of GSSG

表2 馬尾藻多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響Table 2 Effect of the SP on the content of GSH in the spleen lymphocytes of chickens（μmol·L-1）

2.4 馬尾藻多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSH／GSSG比值的影響

結(jié)果見表4。由表4可見，各濃度馬尾藻多糖與雞脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)4、8、12h均不同程度升高細(xì)胞內(nèi)GSH／GSSG比值，與空白對照組比較，差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01），表明馬尾藻多糖能升高雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSH／GSSG比值。

表3 馬尾藻多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSSG含量的影響Table 3 Effect of the SP on the content of GSSG in the spleen lymphocyte of chickens（μmol·L-1））

表4 馬尾藻多糖對雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSH／GSSG比值的影響Table 4 Effect of the SP on the ratio of GSH／GSSG in the spleen lymphocyte of chickens（μmol·L-1）

3 討論

氧化還原狀態(tài)在細(xì)胞調(diào)控中的重要性已逐漸被人們所認(rèn)識。在生理?xiàng)l件下，細(xì)胞對氧化還原狀態(tài)有著精密的調(diào)控，使細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)，以保證細(xì)胞的正常生命活動。氧化還原作用影響細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶和生物大分子的活性，以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、壞死等許多生理、病理過程［8］。因此，監(jiān)測體液的氧化還原狀態(tài)已成為近年來人們高度重視的一個研究領(lǐng)域。氧化劑與抗氧化劑的活性與比例決定著細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，而氧化還原對是直接應(yīng)對細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的物質(zhì)，是直接反映氧化還原狀態(tài)的可靠指標(biāo)。細(xì)胞內(nèi)主要的氧化還原對包括氧化型與還原型輔酶Ⅱ（NADPH／NADP＋）、氧化型與還原型硫氧還蛋白（TRXRED／TRXOX）、氧化型與還原型谷胱甘肽（GSH／GSSG）。其中，GSH／GSSG是這三對氧化還原對中作用最大的，其含量比其他兩個高出100倍以上［9］。

還原型谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)最重要的非酶類抗氧化物質(zhì)，大量存在于各種細(xì)胞之中，并在多種生理過程中起著重要作用［10］，是構(gòu)成細(xì)胞防御氧化損傷機(jī)制中的第一道防線，是細(xì)胞中的主要氧化還原緩沖劑。GSH能單方面改善細(xì)胞的還原狀態(tài)，提高細(xì)胞的抗氧化能力［11］，因此，其在抵抗自由基損傷、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡方面發(fā)揮著重要作用［11-13］。在本研究中，終濃度為12.5、25、50、100、200μg／mL的馬尾藻多糖與雞脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)4、8、12h均能不同程度的提高細(xì)胞中GSH水平，與對照組相比差異顯著（P＜0.05），但隨培養(yǎng)時間的延長至24h時有明顯下降趨勢，培養(yǎng)到24h時恢復(fù)到正常水平。馬尾藻多糖濃度僅為12.5μg／mL時即能提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量，說明馬尾藻多糖有使細(xì)胞趨于還原狀態(tài)的趨勢，有助于細(xì)胞抵御過多的氧化劑對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的直接作用。

氧化型谷胱甘肽（GSSG）本身并無清除自由基的作用，但其能作為GSH還原酶底物參與維持兩種形態(tài)的谷胱甘肽的動態(tài)平衡，也是測定細(xì)胞氧化還原能力的指標(biāo)之一。GSSG在細(xì)胞中積累過多時，會破壞細(xì)胞氧化還原動態(tài)平衡，給生物體帶來不良影響［14］。本研究結(jié)果表明，終濃度為12.5、25、50、100、200μg／mL的馬尾藻多糖與雞脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)4、8、12h均能明顯降低雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)GSSG水平，與對照組相比差異顯著（P＜0.05），且隨著多糖濃度的增加GSSG水平降低程度增大，但隨培養(yǎng)時間延長至24h時，逐漸恢復(fù)到正常水平。提示馬尾藻多糖使GSSG在雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)的含量維持在較低的生理水平，防止細(xì)胞處于過氧化狀態(tài)，維持著細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)平衡。

GSH／GSSG比值是衡量細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的重要指標(biāo)，生物體內(nèi)GSH和GSSG通常處于穩(wěn)恒性動態(tài)平衡下，即當(dāng)機(jī)體內(nèi)GSH清除自由基作用導(dǎo)致GSSG累積，GSH還原酶將GSSG還原成GSH。當(dāng)細(xì)胞處于過氧化狀態(tài)時，可引起GSSG濃度升高或比值降低，常用來評價(jià)氧化劑與抗氧化劑間的動態(tài)平衡［15］。本研究結(jié)果表明終濃度為12.5、25、50、100、200μg／mL的馬尾藻多糖與雞脾臟淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)4、8、12h均能明顯升高GSH／GSSG的比值，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。提示馬尾藻多糖能通過升高GSH／GSSG的比值，使細(xì)胞處于還原態(tài)，從而發(fā)揮其抗氧化作用。

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