劉慎思

摘 要 實(shí)驗以w-13、w-15、w-17，zyz-4892等四個豌豆品系為觀察對象，用石蠟切片發(fā)和平板培養(yǎng)法觀察豌豆的根瘤形態(tài)結(jié)構(gòu)和根際微生物群落。結(jié)果表明，豌豆品系w-17與本地土著根瘤菌適應(yīng)性最好，其次是w-15，而zyz-4892與w-15不適應(yīng)本地根瘤菌。在土壤微生物培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，根瘤數(shù)量可能與根際細(xì)菌數(shù)量成正線性相關(guān)，而土壤根際放線菌的數(shù)量，結(jié)瘤明顯的w-13和w-17品系是結(jié)瘤不明顯品系w-15和zyz-4892的9倍。

關(guān)鍵詞 豌豆；根瘤結(jié)構(gòu)；根際微生物

中圖分類號：S643.3；S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-890X（2015）12-001-02

豌豆（Pisum sativum）是繼大豆之后的第二大食用豆類作物[1]，富含碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、粗纖維以及維生素B1、維生素B2、維生素C等。豌豆具有根瘤固氮的特性，種植豌豆可以用地養(yǎng)地結(jié)合，糧、菜、飼兼用，豌豆作物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和自然氮素平衡中發(fā)揮著重要作用。應(yīng)用生物固氮能有效減少氮肥的使用，對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展有至關(guān)重要的戰(zhàn)略意義。

大量研究表明，在高產(chǎn)豌豆種植技術(shù)中，人工根瘤菌接種是提升豌豆產(chǎn)量的有效途徑。但是有些研究指出，在實(shí)際農(nóng)業(yè)種植中接種根瘤菌的增產(chǎn)效果有時并不明顯，這可能是因為土壤中有大量的競爭能力強(qiáng)但固氮效率低的土著菌群，它們對接種的根瘤菌競爭結(jié)瘤的能力產(chǎn)生了干擾和削弱。接種根瘤菌是否成功，大部分來自于接種的菌株的結(jié)瘤競爭能力，而結(jié)瘤率是測量競爭結(jié)瘤能力的重要指標(biāo)。本實(shí)驗選取四個豌豆品系，以豌豆的根瘤和根際微生物為研究對象，用石蠟切片法、平板梯度稀釋法研究豌豆根瘤結(jié)構(gòu)和豌豆根際微生物群落的分布，分析影響豌豆結(jié)瘤的因素，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中人工接種根瘤菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試豌豆品系

處在開花時期的豌豆品系w-13、w-15、w-17，zyz-4892。四個豌豆品系的根瘤均來自湖北豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心永安基地。采集時，觀察根瘤的形態(tài)及著生位置，經(jīng)清洗后及時固定于FAA液中。

1.2 實(shí)驗方法

根瘤結(jié)構(gòu)觀察用石蠟切片法；微生物的數(shù)量測定采用平板梯度稀釋法。其中細(xì)菌培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，放線菌培養(yǎng)基為高氏1 號瓊脂培養(yǎng)基。

2 結(jié)果與分析

2.1 四個豌豆品系的根系形態(tài)及結(jié)瘤情況比較分析

從圖1可以看出，在4個豌豆品系中，w-13的側(cè)根數(shù)目最多，側(cè)根密度最大，其次是zyz-4892；w-17上可以看到其水平生長優(yōu)勢明顯，二級側(cè)根數(shù)量較多，且有較長的側(cè)根分枝；zyz-4892的側(cè)根細(xì)長，側(cè)根上分枝稀疏，根表皮顏色較其它3個品系淺；w-15在4個品系中的主根最發(fā)達(dá)，側(cè)根較粗，但側(cè)根數(shù)量最少，側(cè)根的分枝密度與zyz-4892程度相似。4個豌豆品系中僅有w-13和w-17有一定數(shù)量的根瘤，且有10 mm以上根瘤形成，最大的達(dá)到20 mm；zyz-4892只有少量幾個根瘤形成，與w-13和w-17上形成的較小的根瘤相似，大小多為2～4 mm；在w-15上并沒有找到明顯的根瘤狀組織。所有根瘤形成的位置都在較細(xì)的側(cè)根上。根瘤的形狀、顏色、大小隨品系的不同差異并不明顯，根瘤的形狀均為長棗狀、姜狀或珊瑚狀；根瘤的顏色為乳白色、淺黃色、淺褐色或者褐色。

2.2 不同豌豆品系根瘤結(jié)構(gòu)觀察

從橫切面（圖2）觀察可以看到，被染成深紅色的中心含菌細(xì)胞區(qū)和染色較淺的外皮層。在發(fā)現(xiàn)根瘤的3個豌豆品系中，在皮層細(xì)胞的細(xì)胞壁位置可以有看到有染成紅色的根瘤菌，其中以w-13的最為明顯；含菌細(xì)胞區(qū)是根瘤固氮的主要位置，在3個豌豆品系中，w-17的含菌細(xì)胞區(qū)幾乎全被感染細(xì)菌所占滿，以染色的程度來看，w-17的感染細(xì)胞在中心位置分布均勻，而且感染率最高，由此可以看出，w-17與本地土著根瘤菌的適合度最高；從皮層與含菌細(xì)胞之間的分生組織中可以看，出本地根瘤菌在w-17中生長最旺盛。在w-13中，也可以看到，一定數(shù)量的分生組織，但含菌細(xì)胞區(qū)的細(xì)胞感染率沒有w-17的高，且感染面積沒有w-17大。zyz-4892的中心含菌區(qū)與皮層界界限不明顯，且含菌細(xì)胞區(qū)感染細(xì)胞分布稀疏，分生組織數(shù)量較少。從高倍鏡下觀察中心含菌細(xì)胞區(qū)，可以看到，染色部位多處于細(xì)胞壁位置，由皮層細(xì)胞中也可觀察到染紅的菌體分布可知根瘤菌沿著細(xì)胞間隙在內(nèi)部延生，包圍細(xì)胞后向細(xì)胞內(nèi)部侵入。

2.3 根際土壤微生物的分布

4個豌豆品系的根際土壤細(xì)菌數(shù)量呈現(xiàn)顯著性差異（p<0.05），數(shù)量最多的是w-13，其次依次是w-17、zyz-4892、w-15，這與根瘤數(shù)量的多少的順序相一致；w-17的根際土壤真菌數(shù)量顯著高于zyz-4892，而zyz-4892的真菌數(shù)量顯著高于w-13和w-15；在w-13和w-17的根際土壤中放線菌數(shù)量無明顯差異（p>0.05），但它們的放線菌數(shù)量均顯著高于zyz-4892和w-15（p<0.05），且數(shù)量均在zyz-4892和w-15的9倍以上（圖3）。

3 討論

在田間種植中，不同品系的豌豆結(jié)瘤差異可能與根瘤菌的宿主專一性相關(guān)，有很多不同的類型和數(shù)量的土著菌存在土壤中，它們可以最有效地利用土壤中有限的碳源，使它們在結(jié)瘤競爭中得到有力地位。從4個豌豆品系的根瘤結(jié)構(gòu)來看，w-17和w-13均有與土著固氮菌較好的適應(yīng)性，尤其以w-17適應(yīng)性最好，這應(yīng)該與土壤中的根瘤菌種類相關(guān)，以往的研究也表明，至今為止還沒發(fā)現(xiàn)能在結(jié)瘤競爭方面超過土著根瘤菌的根瘤菌[2]。

在4個豌豆品系中，根際微生物中真菌數(shù)量均較高，可能與花期時根際微生物變化有關(guān)，陳宏宇等人在大豆品系合豐25號根表面及根際微生物體系的變化中也說明大豆根際細(xì)菌在生育期數(shù)目有遞減的趨向，在成熟期根際的真菌有大批的聚集[3]。根際土壤中大量放線菌生長，可能與放線菌為腐生型菌和田間較高的肥力有關(guān)，而w-13和w-17根際防線菌數(shù)量遠(yuǎn)高于zyz-4892和w-15，可能w-13和w-17較高的結(jié)瘤率有關(guān)，有前人研究發(fā)現(xiàn)在草本中，豆科植物的根際放線菌數(shù)目顯著高于非豆科植物[4]，即可能在同一物種內(nèi)根瘤較多的個體，根際放線菌數(shù)量多于其它個體。

根瘤菌競爭結(jié)瘤的影響因素還有很多，如土壤類型、肥沃程度、異類微生物的競爭、寄主的病蟲害和一些農(nóng)業(yè)措施。等。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物的研究呈現(xiàn)出快速發(fā)展的趨勢，尤其是醫(yī)學(xué)微生物和食品微生物學(xué)。關(guān)于根際微生物之間的相互作用有了進(jìn)一步的了解，對于植物生長的促進(jìn)和保護(hù)具有深遠(yuǎn)的意義。現(xiàn)在國內(nèi)外關(guān)于土壤根際微生物的關(guān)系的研究雖然廣泛，但還不夠完善。但在這一領(lǐng)域，一些新的技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用，在根際微生物的應(yīng)用研究在不久的將來肯定會取得更大的進(jìn)步。

參考文獻(xiàn)

[1]鄭卓杰.中國食用豆類學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：103.

[2]李阜棣，胡正嘉.微生物學(xué)[M].第5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：7.

[3]陳宏字，李曉鳴，王敬國.抗病性不同大豆品系根面及根際微生物區(qū)系的變化II.連作大豆（重茬）根面及根際微生物區(qū)系的變化[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2006，12（1）：104-108.

[4]王從彥，曹震，王磊，等.豆科植物對根際土壤微生物種群及代謝的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2013， 22（1）：85-89.

（責(zé)任編輯：劉昀）