賽珊 趙楠 武瑞娜 李霞

摘 要 海帶配子體克隆技術(shù)的建立具有極其重要的應(yīng)用價(jià)值。配子體克隆及其雜交為通過(guò)雜交方法培育優(yōu)良品種和雜交海帶提供了可能。為此，配子體克隆演變?yōu)楹ХN質(zhì)資源保存和利用的主要手段。

關(guān)鍵詞 青霉素；海帶；配子體培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S968.421 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-890X（2015）12-128-02

海帶屬（Laminaria）褐藻具有異型世代交替生活史，包括二倍性孢子體世代和單倍性配子體世代。20世紀(jì)70年代末，我國(guó)遺傳學(xué)家方宗熙等發(fā)現(xiàn)在人工培養(yǎng)條件下，雌、雄配子體都能形成無(wú)性繁殖系（克?。?，并能產(chǎn)生配子[1]。在海帶育種、育苗、生理及遺傳學(xué)研究中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[2-3]。目前，海帶種質(zhì)保存技術(shù)主要以保存配子體為主，方法主要是通過(guò)人工擦洗抱子囊去除附著的污物和其他生物，然后在煮沸過(guò)的海水中放散得到配子體。而這種方法得到的海帶配子體在保存過(guò)程中，仍會(huì)存有許多細(xì)菌并大量繁殖，附著在配子體克隆體表，阻礙了配子體的正常生長(zhǎng)，對(duì)海帶配子體的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，除此之外，日常管理中的一些操作，也會(huì)帶進(jìn)污染物，導(dǎo)致配子體克隆停止生長(zhǎng)、色素變淡，但具體機(jī)理不明，推測(cè)是生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)性的抑制。

為此，嘗試?yán)们嗝顾貋?lái)抑制細(xì)菌。青霉素是人類歷史上發(fā)現(xiàn)的第一種抗生素，且應(yīng)用非常廣泛。青霉素類抗生素是β-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱，它們具有相似的作用機(jī)理。細(xì)菌一般都處于低滲（即外界的滲透壓低于細(xì)菌體內(nèi)部）的環(huán)境中，因而會(huì)自發(fā)地吸收外界的水分。為了防止細(xì)胞因吸水過(guò)多而膨脹炸裂，細(xì)菌在其細(xì)胞壁中合成一種名為肽聚糖的物質(zhì)，以此抵抗細(xì)菌體的自發(fā)吸水膨脹。青霉素即作用于肽聚糖的合成過(guò)程中，阻止它的合成，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌體失去抵抗?jié)B透壓的能力而脹破[4]。

1 材料

選取的實(shí)驗(yàn)材料為901雜交海帶的雌性配子體克隆，它是一個(gè)比較有代表性的材料，抗逆性比較強(qiáng)[5]。具體選擇青霉素G鈉作為該實(shí)驗(yàn)用抗生素。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)的消毒的方法

種質(zhì)保存的條件之一就是相對(duì)的無(wú)污染，且要排除物品上污染的干擾，故實(shí)驗(yàn)所用材料和物品初始需要相應(yīng)的消毒或滅菌。

2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料的消毒

實(shí)驗(yàn)用的901雜交海帶的雌性配子體是使用無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)得來(lái)[6]。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)物品的消毒

實(shí)驗(yàn)所用的物品經(jīng)過(guò)120 ℃，20 min蒸汽高壓滅菌后，再經(jīng)過(guò)烘箱120 ℃，2 h高溫處理。

2.1.3 培養(yǎng)液的消毒

所用海水經(jīng)過(guò)沉淀，沙濾后，經(jīng)過(guò)活性炭吸附，再由5 μm和1 μm規(guī)格pp棉過(guò)濾，得到最終的海水。添加N（10 g/L）、P（1 g/L），青霉素G鈉（12 mg/mL）配制成培養(yǎng)液，N、P的母液均是經(jīng)過(guò)120 ℃，20 min蒸汽高壓滅菌處理。

2.1.4 培養(yǎng)液的抽濾

加有青霉素G鈉的培養(yǎng)液需要通過(guò)膜濾器抽濾的方法處理。采用的濾膜為孔徑是0.22 μm醋酸纖維酯微孔濾膜，孔徑有效地達(dá)到了除菌的目的，其不帶電荷的特性又可最大程度地保留培養(yǎng)液中的有效成分。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

為了擁有一個(gè)良好的初始狀態(tài)，先用超聲波粉碎儀將一定量的901雜交海帶的雄性配子體克隆簇打碎成較短的細(xì)胞段[7]，多次更換培養(yǎng)液后，再經(jīng)過(guò)7 d的自然光生長(zhǎng)恢復(fù)。

設(shè)置3組實(shí)驗(yàn)，第1組始終使用加有青霉素G鈉的培養(yǎng)液，第二組中期停加青霉素，改用普通培養(yǎng)液，而最后一組始終使用普通的未加青霉素G鈉的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)在在10 ℃，光照強(qiáng)度1500Lx培養(yǎng)。

在傳統(tǒng)海帶配子體克隆種質(zhì)資源保存過(guò)程中，會(huì)定期更換培養(yǎng)液。更換培養(yǎng)液的周期一般為30 d。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間的操作，包括更換培養(yǎng)液和觀察都在超凈工作臺(tái)內(nèi)完成，瓶口等都在酒精燈下過(guò)火，確保實(shí)驗(yàn)不被干擾。為了能及時(shí)有效地掌握信息，7 d觀察一次。

3 結(jié)果和討論

3.1 結(jié)果

經(jīng)過(guò)120 d的培養(yǎng)后，我們發(fā)現(xiàn)，始終使用加有青霉素G鈉組是最好的一組，整個(gè)過(guò)程中都不見(jiàn)其它污染物，但顯微鏡下觀察，偶見(jiàn)有孢子體的出現(xiàn)。始終未加入青霉素G鈉組，在后期出現(xiàn)了少量的桿菌和球菌。對(duì)此，改用加有青霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)一段時(shí)間后，桿菌和球菌明顯減少，但是出現(xiàn)了一種有絲真菌?？梢?jiàn)，利用青霉素來(lái)培養(yǎng)海帶配子體是可行的，而且對(duì)已有的污染物能夠很好的控制。

3.2 討論

第一，青霉素G鈉水溶液極不穩(wěn)定，青霉素G鈉鹽易水解，在不同溫度下有效期有很大差異，它隨著溫度的升高，水解加速。所以配制好的青霉素G鈉培養(yǎng)液要及時(shí)地使用[8]；第二，為了能有效地控制細(xì)菌，每隔一段時(shí)間都要使用帶有青霉素G鈉的培養(yǎng)液更換；第三，雖然海帶配子體和細(xì)菌的細(xì)胞壁組成不同，所以青霉素不會(huì)影響海帶配子體細(xì)胞壁合成，但是長(zhǎng)時(shí)間接觸青霉素，對(duì)海帶配子體細(xì)胞的其它細(xì)胞器有無(wú)影響，尤其是核心的遺傳物質(zhì)，特別是第一組出現(xiàn)了孢子體，還有待討論；第四，培養(yǎng)后期出現(xiàn)了其它的污染物，青霉素?zé)o法控制，以后可以試驗(yàn)加入其它藥物聯(lián)合處理。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)任編輯：趙中正）