張 勤， 鄭司鵬， 劉 紅， 刁曉潔， 賈 瑩

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830000； 2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

大鼠下頜前導(dǎo)后髁突軟骨組織中BMP-2的含量變化研究

張 勤1， 鄭司鵬1， 劉 紅1， 刁曉潔1， 賈 瑩2

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830000；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸教研室， 貴州 貴陽(yáng) 550002)

目的 探討下頜前導(dǎo)對(duì)大鼠髁突軟骨細(xì)胞骨形成蛋白-2(BMP-2)含量的影響。方法 64只雄性SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠全天佩戴自制的前導(dǎo)裝置，對(duì)照組不佩戴矯治器。于第0、1、3、5天及第1、2、4、8周分別處死各組大鼠，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)定量檢測(cè)、分析大鼠髁突軟骨內(nèi)BMP-2的含量變化。結(jié)果 (1)與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠髁突軟骨BMP-2含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。隨加力時(shí)間進(jìn)展，BMP-2含量也隨之改變，各時(shí)間點(diǎn)BMP-2含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。(2)下頜前導(dǎo)加載后髁突軟骨細(xì)胞BMP-2含量與時(shí)間呈二次項(xiàng)(拋物線)模型趨勢(shì)，體現(xiàn)一定的時(shí)間節(jié)律(P=0.000)。結(jié)論 下頜前導(dǎo)能夠促進(jìn)髁突軟骨細(xì)胞BMP-2的釋放含量，從而可能參與髁突軟骨的骨改建過(guò)程。

下頜前導(dǎo)； 大鼠髁狀突軟骨細(xì)胞； 骨形成蛋白-2

目前，對(duì)骨性安氏Ⅱ類錯(cuò)頜畸形的臨床矯治，其理想目標(biāo)是期望實(shí)現(xiàn)骨改良，誘導(dǎo)下頜骨向前、上生長(zhǎng)及位移。然而，下頜前導(dǎo)矯治裝置究竟能否切實(shí)產(chǎn)生骨效應(yīng)，對(duì)其作用機(jī)制，業(yè)界尚存在廣泛爭(zhēng)議。骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)具有誘導(dǎo)骨與軟骨形成及保持軟骨表型等功能，是參與軟骨和骨發(fā)育的重要的細(xì)胞因子[1]，在骨組織修復(fù)工程中應(yīng)用廣泛。因此，本研究擬通過(guò)觀察功能性下頜前導(dǎo)裝置對(duì)大鼠髁突軟骨BMP-2含量的影響，初步探討下頜前導(dǎo)矯治可能的骨性效應(yīng)及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康雄性SD大鼠64只，35天齡(貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。根據(jù)是否安放前導(dǎo)咬合裝置，將所有動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(安放前導(dǎo)裝置)和對(duì)照組(不安放前導(dǎo)裝置)，自口內(nèi)咬合板放置完成記為第0天，并設(shè)立觀察時(shí)間點(diǎn)第0、1、3、5天及第1、2、4、8周。各時(shí)間點(diǎn)分別麻醉后處死各組大鼠，取雙側(cè)髁突組織，保存待用。

1.2 主要器材、試劑下頜前導(dǎo)矯治裝置(參照Rabie等[2]方法)(圖1)，登泰克通用光固化樹脂(登泰克牙科樹脂有限公司),大鼠BMP-2 ELISA檢測(cè)試劑盒(BMP-2 ELISA Kit,96T，Promage)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone,USA)。

圖1 大鼠下頜前導(dǎo)裝置

1.3 安放前導(dǎo)咬合裝置實(shí)驗(yàn)組大鼠用0.3%戊巴比妥鈉1 mL/100 g腹腔注射麻醉，起效后，按照樹脂粘接步驟分別對(duì)大鼠上頜中切牙進(jìn)行牙面酸蝕、干燥等處理，粘接預(yù)制好的前導(dǎo)咬合板?？趦?nèi)檢查并拖曳大鼠下頜向前至切牙對(duì)刃位置，修形、加固樹脂以確保阻擋下頜后退。對(duì)照組不作處理。所有動(dòng)物同條件飼養(yǎng)。

1.4 軟骨細(xì)胞的分離及細(xì)胞凍融動(dòng)物麻醉處死后，取下雙側(cè)髁狀突，將其軟骨層剝離，按矢狀向切取前、中、后軟骨組織。無(wú)菌條件下剪碎組織塊，移入無(wú)鈣平衡鹽液(D-Hank’s液)中，10倍量0.25%胰蛋白酶37℃振蕩消化30 min；0.2%Ⅱ型膠原酶1 mL，混勻，37℃振蕩消化2 h；15%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心8 min；去上清液，加入含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻，轉(zhuǎn)移至25 mL培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后每隔2 天換液。透明軟骨細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞。按5×106個(gè)/孔接種密度制備細(xì)胞懸液并移入1 mL EP管中，-20℃反復(fù)凍融3次。取細(xì)胞凍融液，待測(cè)。

1.5 BMP-2含量測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法定量測(cè)定大鼠髁突軟骨細(xì)胞凍融液BMP-2含量，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按試劑盒使用說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果

2.1 下頜前導(dǎo)力學(xué)加載引起大鼠髁突軟骨BMP-2含量變化與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠髁突軟骨BMP-2含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。隨加力時(shí)間進(jìn)展，BMP-2含量也隨之改變，各時(shí)間點(diǎn)BMP-2含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)，見(jiàn)表1、圖2。

2.2 大鼠髁突軟骨BMP-2含量與加力時(shí)間的關(guān)系大鼠髁突軟骨BMP-2含量與加力時(shí)間呈二次項(xiàng)(拋物線)模型趨勢(shì)(Quadratic,P=0.000)(圖3)。

2.3 髁突軟骨矢狀向分割區(qū)域BMP-2含量?jī)山M髁突軟骨矢狀向前、中、后區(qū)域BMP-2含量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

圖2 髁突軟骨細(xì)胞力學(xué)加載-BMP-2含量分布

圖3 髁突軟骨細(xì)胞BMP-2含量-時(shí)間曲線

表1 髁突軟骨細(xì)胞BMP-2含量測(cè)定結(jié)果(±s， ng/mL)

3 討論

臨床上骨性安氏Ⅱ類錯(cuò)頜畸形、下頜骨功能性前伸后、下頜骨髁突的改建是整個(gè)矯治成功的關(guān)鍵。矯治II類錯(cuò)頜最佳時(shí)機(jī)是患者恰好處于生長(zhǎng)發(fā)育高峰期，本實(shí)驗(yàn)選擇第35天齡的SD大鼠作為研究對(duì)象，且SD大鼠的顳下頜關(guān)節(jié)與人類相似，髁突軟骨發(fā)育規(guī)律也呈周期性變化，可以代表臨床上處于快速生長(zhǎng)發(fā)育期的青少年。本實(shí)驗(yàn)的大鼠前導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是常用的研究模型，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，僅出現(xiàn)2例樹脂咬合板部分松脫、損壞的情況(可能是粘接安放過(guò)程中唾液隔濕不好所致)，有效地保證了實(shí)驗(yàn)條件的均一性，確保了觀察髁突軟骨組織改建及變化的可靠性。劉瑩等[3]的研究也證實(shí)了這個(gè)結(jié)果。

本研究在實(shí)驗(yàn)方法上也進(jìn)行了科學(xué)地設(shè)計(jì)，對(duì)髁突軟骨原代細(xì)胞分離、培養(yǎng)擴(kuò)增后即收獲并制取細(xì)胞凍融液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，避免了細(xì)胞傳代培養(yǎng)可能引起的細(xì)胞狀態(tài)及生物學(xué)信息的丟失或改變，竭力保留了實(shí)驗(yàn)干預(yù)措施(下頜前導(dǎo))對(duì)髁突軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為影響的原始狀態(tài)，確保BMP-2檢測(cè)結(jié)果的客觀性和科學(xué)性[4]， 此與以往類似的研究[1]比較具有一定的先進(jìn)性。

髁狀突是下頜骨的重要的生長(zhǎng)發(fā)育區(qū)，下頜前導(dǎo)裝置引起髁突位置改變后，相應(yīng)的機(jī)械刺激能夠引起髁突及顳頜關(guān)節(jié)發(fā)生一系列生物學(xué)改建。骨骼的改建需要各種生長(zhǎng)因子的共同調(diào)控，使骨組織的吸收和形成維持著一種新的動(dòng)態(tài)平衡。BMP-2是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族成員中最主要的骨形成調(diào)控因子，能通過(guò)提高和堿性磷酸酶的活性和增加骨鈣素及膠原蛋白的表達(dá)、合成及礦化小節(jié)的形成來(lái)刺激成骨細(xì)胞的分化 。BMP-2 還能引起多種細(xì)胞的增殖、分化和凋亡， 參與組織的再生和修復(fù)，尤其是骨和軟骨的修復(fù)及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化[1]。因此，本研究希望通過(guò)觀察下頜前導(dǎo)裝置戴入后髁突軟骨BMP-2表達(dá)的時(shí)間變化規(guī)律，進(jìn)一步研究BMP-2在髁突軟骨改建中的可能機(jī)制及作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下頜前導(dǎo)力學(xué)加載能夠影響髁突軟骨細(xì)胞凍融液BMP-2濃度的變化，高于對(duì)照組水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示下頜前導(dǎo)負(fù)荷能夠促進(jìn)髁突軟骨釋放BMP-2，從而參與髁突軟骨的成骨改建[5]。此結(jié)果與相關(guān)的研究結(jié)果一致[6-7]。推測(cè)BMP-2可能參與了下頜前伸過(guò)程中的髁突改建。

本實(shí)驗(yàn)從矢狀方向?qū)镣卉浌菂^(qū)域進(jìn)行了分割，試圖進(jìn)一步探究下頜前伸時(shí)軟骨改建的區(qū)域分布特征。然而實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能反映BMP-2含量存在矢狀向區(qū)域分布差異，結(jié)果表明無(wú)論是對(duì)照組還是實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)間點(diǎn)髁突前、中、后區(qū)域BMP-2含量較均勻，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示矢狀區(qū)域分布，髁突軟骨BMP-2含量較均勻。

趙志河等[8]建立的下頜骨三維有限元模型揭示下頜前伸時(shí)髁突后上部是張應(yīng)力區(qū)，前部是壓應(yīng)力區(qū)，有利于髁突向前下方向位移。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)BMP-2是在顳頜關(guān)節(jié)區(qū)負(fù)荷改變時(shí)參與一系列改建活動(dòng)的其中一種細(xì)胞因子，尚不具有位置特異性標(biāo)志特征，亦無(wú)法敏感地反映負(fù)荷的性質(zhì)。另一種可能是本研究劃分髁突區(qū)域的方法不夠精確，無(wú)法完全代表髁突負(fù)載的真實(shí)情況，還需要在以后的研究中反復(fù)地實(shí)踐證實(shí)。

本研究顯示髁突軟骨受下頜前導(dǎo)力學(xué)負(fù)載后，BMP-2含量變化與時(shí)間變量呈拋物線模型趨勢(shì)，即在加力后第5～7 天時(shí)出現(xiàn)峰值含量，以后逐漸回落，接近初始水平；而對(duì)照組BMP-2未出現(xiàn)明顯的峰值,此結(jié)果反映了大鼠髁突軟骨釋放BMP-2具有一定的時(shí)間節(jié)律。顳頜關(guān)節(jié)力學(xué)負(fù)載能夠引起B(yǎng)MP-2的快速參與和反應(yīng)；而后期回落則可能是髁突對(duì)力學(xué)加載適應(yīng)性改建的結(jié)果。BMP-2參與髁突改建的機(jī)制還有待后續(xù)的研究證實(shí)。

[1]DeLucaF,BarnesKM,UyedaJA,etal.Regulationofgrowthplatechondrogenesisbybonemorphogeneticprotein-2[J].Endocrinology,2001,142(1):430-436.

[2]RabieAB,WongL,TsaiM.Replicatingmesenchymalcellsinthecondyleandtheglenoidfossaduringmandibularforwardpositioning[J].AmJOrthodDentofacialOrthop,2003 123(1):49-57.

[3] 劉瑩，湯歡，劉艷艷，等. 不同下頜前伸力對(duì)髁突Runx2 和X型膠原表達(dá)的影響[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 29(5)：621-625.

[4] 金波濤,于紹冰,鄭衛(wèi)衛(wèi),等.失重對(duì)大鼠髁突軟骨細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)的影響[J].實(shí)用醫(yī)藥雜志,2014, 31(1):47-48.

[5]ValteauB,GrimardG,LondonoI,etal.Invivodynamicbonegrowthmodulationislessdetrimentalbutaseffectiveasstaticgrowthmodulation[J].Bone,2011,49(5):996-1004.

[6] 李曉峰,王美青,儲(chǔ)嵐嵐,等.咬合紊亂與去除咬合紊亂對(duì)大鼠髁突軟骨中骨形成蛋白-2表達(dá)的影響[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2008,26(1):105-108.

[7] 盧紅飛,麥志輝,艾虹,等.機(jī)械牽張力作用下小鼠成骨細(xì)胞骨形成蛋白-2的濃度變化[J].中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,5(5):488-493.

[8] 趙志河,周學(xué)東,趙美英.下頜前伸時(shí)髁突的三維有限元分析[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,1999,34(2):85-87.

(本文編輯 楊晨晨)

The content of the BMP-2 in the cartilage of rat condyle after mandibular advancement

ZHANG Qin1, ZHENG Sipeng1, LIU Hong1, DIAO Xiaojie1, JIA Ying2

(1TheAffiliatedTraditionalChineseHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,China;2AffiliatedStomatologySchool,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To observe the changes of Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) in the cartilage of rat condyle after mandibular constantly advancement and its impact on the condylar cartilage. Methods A total of 64 male rats were randomly divided into experimental and control groups. In the experimental group, each rat were worn on the bite-jumping appliances in order to advance the mandible for 24 hours. The rats were executed in each group after 0 d, 1 d, 3 d, 5 d, 1 w, 2 w, 4 w and 8 w. BMP-2 content was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results (1) The BMP-2 content was increased in the condylar cartilage. Compared with the control group, the difference was statistically significant (P=0.000).Alongwiththestrengthtimeprogress,BMP-2contentalsochanged,theBMP-2contentofeachtimepointwasdifferentsignificantly(P=0.011). (2)Afterwearingofbite-jumpingappliances,BMP-2contentinthemandibularcondylarchondrocytesandtimepresentaquadratictrend(parabolic)model,andreflectacertainamountoftimerhythm(P=0.000). Conclusion The bite-jumping appliance can promote the release of the condylar chondrocytes BMP-2 levels, which could participate in the process of condylar cartilage bone reconstruction.

bite-jumping; cartilage cells of rat; BMP-2

新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金(ZYY201208)

張 勤(1965-)，女，本科，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：口腔正畸學(xué)。

賈 瑩，女，碩士，副教授，研究方向：口腔正畸學(xué),E-mail：1746870529@qq.com。

R

A

1009-5551(2015)12-1489-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.12.008

2015-07-14]