秦慶芳，粟本超

(1.廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗(yàn)所，柳州 545006；2.廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，柳州 545004)

廣西不同地區(qū)喜樹嫩葉中喜樹堿含量測(cè)定*

秦慶芳1，粟本超2

(1.廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗(yàn)所，柳州 545006；2.廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，柳州 545004)

目的 對(duì)廣西不同土質(zhì)和海拔喜樹嫩葉中的喜樹堿含量進(jìn)行分析比較。方法 采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定喜樹堿含量。色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(27：73)；流速：1.0 mL· min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。結(jié)果 在20 min內(nèi)完成對(duì)喜樹嫩葉中喜樹堿的色譜分析，且主成分峰與相鄰的色譜峰之間分離度均>2.0；喜樹堿的線性范圍為0.074 35～0.743 5 μg(r=1)，平均加樣回收率96.48%(n=9)。喜樹堿含量(單株)比較，生長(zhǎng)在海拔500～1 000 m的喜樹中喜樹堿含量最高；石山生長(zhǎng)的喜樹中喜樹堿含量大于土山。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便，快速，準(zhǔn)確，可用于測(cè)定喜樹嫩葉中喜樹堿的含量。

喜樹嫩葉；喜樹堿；含量測(cè)定

喜樹(CamptothecaacuminataDecne.)嫩葉為珙桐科植物喜樹的干燥嫩葉，主要分布在長(zhǎng)江流域及西南各省[1]。喜樹堿(camptothecin，CPT)是喜樹全株中含有的一種吲哚生物堿[2]，具有顯著的抗癌活性，是迄今發(fā)現(xiàn)唯一一種專門通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I發(fā)揮細(xì)胞毒性的天然植物活性成分[3]。由于CPT溶解度低，對(duì)人體毒、副作用大，暫無臨床應(yīng)用價(jià)值[4]，但通過對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾或直接篩選與結(jié)構(gòu)相類似的衍生物，既能保持其原有的抗癌活性，又能提高其溶解度，減少毒副反應(yīng)，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值[5]。目前CPT-11、拓?fù)涮婵?topotecan，TPT)等喜樹堿衍生物已被美國(guó)食品和藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA) 批準(zhǔn)用于臨床治療癌癥[6]。喜樹各器官中CPT的含量存在較大差異，早期研究認(rèn)為，果實(shí)中CPT含量高。近年研究表明，喜樹嫩葉為富含CPT的器官，可以達(dá)到植株地上部分平均含量的4倍[7-8]，而且最佳的是廣西產(chǎn)喜樹嫩葉 (含量1.69‰)[9]。以葉片為原料不僅采集方便、受季節(jié)影響小，而且合理的采集量還能減少對(duì)資源和環(huán)境的破壞。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中以CPT含量為標(biāo)準(zhǔn)，用HPLC法測(cè)定廣西12個(gè)縣47批喜樹單株嫩葉中CPT含量，分析影響CPT含量的因素，以期為篩選廣西喜樹堿優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器)；超純水器(Molecular)，超聲波發(fā)生器(SK8200HP)。電子分析天平(METTLER TOLEDO，型號(hào)：XS205，XP26，感量分別為0.1 mg和0.001 mg)。

1.2 試藥 喜樹嫩葉來自廣西興安縣3個(gè)單株(單株編號(hào)：XA1～XA3下同)、靈川縣1個(gè)單株(LC1)、永?？h2個(gè)單株(YF1和YF2)、天峨縣3個(gè)單株(TE1～TE3)、南丹縣5個(gè)單株(ND1～ND5)、東蘭縣5個(gè)單株(DL1～DL5)、隆林縣新州鎮(zhèn)4個(gè)單株(LLa1～LLa4)、隆林縣德峨鄉(xiāng)9個(gè)單株(LLb1～LLb9)、凌云縣2個(gè)單株(LY1和LY2)、西林縣4個(gè)單株(XL1～XL4)、金秀縣2個(gè)單株(JX1和JX2)、田林縣3個(gè)單株(TL1～TL3)、德?？h2個(gè)單株(DB1和DB2)共12個(gè)縣13個(gè)采集點(diǎn)的47個(gè)單株，采樣點(diǎn)為樹高約2 m處某一側(cè)枝從頂芽往下50 cm范圍內(nèi)的所有葉片。以上所有的喜樹單株均經(jīng)廣西生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院蘇付保教授鑒定為喜樹。喜樹堿對(duì)照品(批號(hào)：100532-200401，含量：100%)來自中國(guó)食品藥品檢定研究院。乙腈、乙醇、甲醇、丙酮等試劑均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃ 流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 對(duì)照品和供試品的制備 樣品前處理：將樣品放在干燥的室內(nèi)自然風(fēng)干，用高速中藥粉碎機(jī)粉碎，過4號(hào)篩網(wǎng)(65目，篩孔內(nèi)徑250 μm)，置于40 ℃干燥箱中干燥12 h，放冷，放入干燥器中備用。

供試品溶液：取上述粉碎干燥的樣品0.5 g，精密稱定，置10 mL量瓶，加入60%乙醇溶液約9 mL，50 ℃下超聲提取10 min，取出，放冷，用60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品儲(chǔ)備溶液制備：取喜樹堿對(duì)照品7.435 mg精密稱定，置100 mL量瓶，加60%乙醇溶液至刻度，搖勻，即得。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取“2.2”項(xiàng)對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，照”2.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液色譜圖中均有與喜樹堿保留時(shí)間相同的吸收峰，見圖1。

1.喜樹堿

圖1 喜樹堿對(duì)照品(A)和喜樹嫩葉樣品(B)HPLC圖譜

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2”項(xiàng)所配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液1，3，5，7，9，10 mL置于10 mL量瓶，用60%乙醇溶液分別稀釋并定容，搖勻，即得系列濃度對(duì)照品溶液。按照上述色譜條件分別取系列濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣3 次， 取3次峰面積的平均值。得峰面積(Y)與喜樹堿進(jìn)樣量(X，μg)的線性回歸方程為：Y=4 826.3X-50.84，r=1.000 0。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)所配制的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液10 μL，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，RSD為0.18%，說明儀器精密度較好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取DB1樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算得喜樹堿的平均含量為1.287‰，RSD為0.56%，說明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將DB1供試品溶液，分別靜置0，4，8，12，16 h后進(jìn)樣測(cè)定峰面積，RSD為0.6%。說明穩(wěn)定性好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知喜樹堿含量(JX1)的同一批樣品0.25 g，共9份，3份為一組，每組分別精密加入“2.2”項(xiàng)對(duì)照品儲(chǔ)備液2.8，3.5，4.2 mL混合，按“2.2”項(xiàng)方法制備所需溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，計(jì)算平均回收率和RSD。結(jié)果平均回收率96.48%，RSD為0.4%，說明回收率好。

2.9 樣品含量測(cè)定與分析 精密稱取樣品粉末各0.5 g， 分別按照“2.2”項(xiàng)方法制成供試品溶液。取各供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣3 次。用回歸方程計(jì)算各樣品中CPT的含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

續(xù)表1

由表1可知，排名前5名的單株中有4株分布在海拔500～1 000 m，分別排在1，2，3和5位。可見，海拔影響CPT的含量，在廣西分布在500～1 000 m單株CPT含量較高。另外，比較LLa系列和LLb系列可知， LLb系列9個(gè)單株中有4株(占44.44%)排名進(jìn)入前15名，而LLa系列4個(gè)單株中僅1株(占25.00%)排名進(jìn)入前15名，排在14位。可見，土質(zhì)影響CPT的含量，生長(zhǎng)在石山上的單株CPT含量高于生長(zhǎng)在土山上的單株。

2.10 喜樹嫩葉穩(wěn)定性考察 將10批已知CPT含量的陰干喜樹嫩葉在室溫下避光放置3個(gè)月后，按“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，每份溶液重復(fù)進(jìn)樣3 次。用回歸方程計(jì)算各樣品中CPT含量，并與原來含量比較，結(jié)果見表1。10批樣品CPT含量平均下降16.2%，最高下降達(dá)34.5%。說明喜樹嫩葉中CPT在室溫條件下很不穩(wěn)定。

3 討論

3.1 提取方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品的提取溶劑[不同濃度(40%，60%，70%，80%，100%)的甲醇、乙醇、丙酮]、提取溫度(20，30，40，50，60 ℃)和提取時(shí)間(5，10，20，30，50 min)進(jìn)行了考察研究，結(jié)果表明用60%乙酸50 ℃超聲提取10 min最佳。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取喜樹堿對(duì)照品溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果喜樹堿在254 nm處有最強(qiáng)吸收，大量研究也以254 nm作為喜樹堿的檢測(cè)波長(zhǎng)[8-17]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用254 nm作為紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)[8-17]中的流動(dòng)相和比例，均不能達(dá)到滿意的效果的情況下，考察了乙腈-水和甲醇-水不同梯度配比的流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明：流動(dòng)相為乙腈-水(27：73)時(shí)喜樹堿與相鄰峰的分離度均達(dá)2.0，且喜樹堿峰的理論板數(shù)>5 000。

3.4 樣品干燥方法選擇 由于CPT對(duì)光和熱不穩(wěn)定[18]，因此喜樹嫩葉放置后會(huì)導(dǎo)致CPT含量降低。因自然風(fēng)干樣品干燥程度不一樣，故參考文獻(xiàn)[14]，選擇40 ℃低溫干燥12 h的樣品干燥方法。以避免其含量降低并且達(dá)到樣品干燥的目的。

從47批單株的測(cè)定結(jié)果看出，喜樹堿含量有明顯差異。海拔影響喜樹堿的含量，在廣西分布在500～1 000 m的單株喜樹堿含量較高。土質(zhì)影響喜樹堿的含量，生長(zhǎng)在石山上的單株喜樹堿含量高于生長(zhǎng)在土山上的單株。另外，喜樹嫩葉中CPT不穩(wěn)定，含量容易下降，采集好嫩葉后應(yīng)盡快提取。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.028

2014-01-16

2014-02-20

*2008年度廣西教育廳科研項(xiàng)目(200809MS127)；2012年廣西教育廳高等教育教學(xué)改革工程項(xiàng)目(NO.2012JCA363)

秦慶芳(1971-)，女，廣西桂林人，副主任藥師，學(xué)士，研究方向：食品藥品檢測(cè)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：465764508@qq.com。

粟本超(1971-)，男，廣西桂林人，副教授，碩士，研究方向：植物有效成分提取分離與鑒定。E-mail：sbch_1971@126.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)03-0388-04