謝向陽，陳晨，林雯，李銀科，李旸，陳鷹

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070；2.湖北省黃石市愛康醫(yī)院檢驗(yàn)科，黃石 435000)

重酒石酸長春瑞濱長循環(huán)脂質(zhì)體的制備與表征

謝向陽1，陳晨1，林雯2，李銀科1，李旸1，陳鷹1

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070；2.湖北省黃石市愛康醫(yī)院檢驗(yàn)科，黃石 435000)

目的 采用pH梯度法制備重酒石酸長春瑞濱長循環(huán)脂質(zhì)體并進(jìn)行表征。方法 以粒徑為指標(biāo)，考察水化溫度和擠出次數(shù)對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑的影響；以粒徑及包封率為指標(biāo)，考察孵化溫度和孵化時(shí)間對(duì)載藥脂質(zhì)體粒徑和包封率的影響。并采用Malvern粒度儀測定脂質(zhì)體的粒徑分布、多分散系數(shù)及Zeta電位，透射電鏡考察其形態(tài)，并考察脂質(zhì)體穩(wěn)定性。結(jié)果 重酒石酸長春瑞濱長循環(huán)脂質(zhì)體粒徑(96.4±27.2) nm，多分散系數(shù)(0.162±0.042)，Zeta電位(-26.7±3.5) mV；透射電鏡顯示脂質(zhì)體粒徑均一，成單層膜球狀分布；長期穩(wěn)定性研究顯示，脂質(zhì)體在5 ℃條件下放置3個(gè)月穩(wěn)定。結(jié)論 pH梯度法可以用于重酒石酸長春瑞濱長循環(huán)脂質(zhì)體的制備。

長春瑞濱，重酒石酸；脂質(zhì)體，長循環(huán)；pH梯度法

重酒石酸長春瑞濱(vinorelbine Bitartrate， Vin-B)是一種半合成長春花生物堿，通過抑制微管聚合，誘導(dǎo)微管解聚，使腫瘤細(xì)胞在有絲分裂過程中微管合成障礙，臨床主要用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌、卵巢癌等。由于Vin-B注射液是高滲性藥物，易導(dǎo)致血管通透性增加，引起靜脈和毛細(xì)血管痙攣，導(dǎo)致注射部位靜脈炎、水泡、潰瘍，甚至局部組織壞死[1]，因此嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用[2]。針對(duì)Vin-B注射劑易引起靜脈炎的缺陷，以及在臨床上使用時(shí)需頻繁給藥的缺點(diǎn)。筆者將其制備成長循環(huán)脂質(zhì)體注射劑，以期減輕靜脈炎，改變藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，減少給藥頻率。國內(nèi)已有pH主動(dòng)載藥法制備Vin-B長循環(huán)脂質(zhì)體的相關(guān)報(bào)道，但這些報(bào)道對(duì)該脂質(zhì)體的制備工藝和理化表征描述不全面[3～5]，影響了該制劑的研究和推廣，筆者希望通過本實(shí)驗(yàn)彌補(bǔ)該缺陷。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 脂質(zhì)體擠出器(美國Avanti Polar Lipids)；Agilent1200高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，G1314檢測器)；Mastersizer 2000 粒度分析儀(英國馬爾文公司)；Zetasizer Nano 電位分析儀(英國馬爾文公司)；JM21200EX透射電鏡(日本電子公司)；BT125D電子天平(精度：0.01 mg，德國賽多利斯公司)；GC2120GX 日立冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidere fluoride,PVDF膜(密理博中國公司，規(guī)格：0.22 μm/0.08 μm)。

1.2 試藥 重酒石酸長春瑞濱原料藥(杭州民生藥業(yè)有限公司，批號(hào)：VT121201，純度>99.0%)，重酒石酸長春瑞濱對(duì)照品(多次重結(jié)晶自制，批號(hào)：R130201，純度>99.5%)，大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司，注射級(jí)，批號(hào)：130320)，膽固醇(天津博迪化工有限公司，生化級(jí)，批號(hào)：20100624)，聚乙二醇2000-磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE，上海東尚實(shí)業(yè)有限公司，生化級(jí)，批號(hào)：20110715)，枸櫞酸(上海Sigma試劑有限公司，分析純，批號(hào)：105K4062)，枸櫞酸鈉(上海Sigma試劑有限公司，分析純，批號(hào)：090M01544)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱(200 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：乙腈-磷酸二氫鉀(KH2PO4，0.05 mol·L-1)-三乙胺(35：65：1，磷酸調(diào)pH4.0)；柱溫：35 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。檢測波長：268 nm。

2.1.2 線性范圍考察 稱取Vin-B對(duì)照品10.0 mg，置100 mL量瓶中，加入流動(dòng)相超聲使溶解，放冷至室溫，作對(duì)照品貯備液(100 μg·mL-1)。精密量取0.05，0.1，0.5，1.0，2.0 及3.0 mL 分別置10 mL 量瓶中，用雙蒸水稀釋至刻度，搖勻，即制得濃度為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 及30.0 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取20 μL進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以峰面積(A)對(duì)濃度(C，μg·mL-1)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為A=27.253C-0.695 9，r=0.999 9，表明重酒石酸長春瑞濱在0.5～30.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取10.0 μg·mL-1樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法重復(fù)測定6次，結(jié)果RSD為0.91%(n=6)，表明本方法精密度良好。平行配制6份上述對(duì)照品溶液，分別按“2.1.1”項(xiàng)方法測定絕對(duì)回收率，結(jié)果RSD為1.31%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取10.0 μg·mL-1樣品溶液，在低溫/避光條件下分別放置0，2，4，6，8，12，24 h，按“2.1.1”項(xiàng)方法重復(fù)測定，結(jié)果RSD為0.41%(n=7)，表明溶液穩(wěn)定性良好。

2.1.5 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品貯備液0.1，0.5，1.0 mL，置10 mL量瓶(各3份)，各加入按“2.2.2”項(xiàng)方法制備的空白脂質(zhì)體溶液2 mL，振搖后靜置5 min，加入甲醇溶液稀釋定容，搖勻，用微孔濾膜(孔徑0.22 μm)濾過，精密吸取20 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以測得量除以加入量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2 pH 梯度法制備重酒石酸長春瑞濱長循環(huán)脂質(zhì)體

2.2.1 空白長循環(huán)脂質(zhì)體的制備 稱取處方量大豆磷脂、膽固醇及PEG2000-DSPE(質(zhì)量比3：1：1，總質(zhì)量3.0 g)，溶于30 mL三氯甲烷，置于250 mL茄形瓶，在45 ℃減壓除去有機(jī)溶劑，得到透明均勻薄膜，繼續(xù)抽真空1 h，加入枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(300 mmol·L-1，pH4.0)，55 ℃水化30 min，得空白脂質(zhì)體初品。將空白脂質(zhì)體初品分別經(jīng)過孔徑0.22 μm微孔濾膜的脂質(zhì)體擠出器擠出3次，孔徑0.08 μm微孔濾膜脂質(zhì)體擠出器擠出5次，即得帶乳光空白脂質(zhì)體混懸液，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 重酒石酸長春瑞濱回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 載藥長循環(huán)脂質(zhì)體的制備 取上述空白脂質(zhì)體混懸液5.0 mL，加入磷酸鈉溶液(500 mmol·L-1)3.0 mL 及滅菌注射用水2.0 mL，混合后加入Vin-B溶液(4.0 mg·mL-1)2.5 mL，55 ℃孵化30 min，即得Vin-B長循環(huán)脂質(zhì)體。

其中：C總代表脂質(zhì)體溶液中Vin-B的總濃度；C游離代表脂質(zhì)體溶液中未被包封Vin-B的濃度。

2.4 長循環(huán)脂質(zhì)體制備工藝考察

2.4.1 空白長循環(huán)脂質(zhì)體制備工藝考察

2.4.1.1 水化溫度對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑的影響 按照“2.2”項(xiàng)下制備空白脂質(zhì)體，在45，50，55，60，65 ℃制備空白脂質(zhì)體初品，將空白脂質(zhì)體初品分別經(jīng)孔徑為0.22 μm微孔濾膜的脂質(zhì)體擠出器擠出2次，孔徑0.08 μm微孔濾膜的脂質(zhì)體擠出器擠出5次后，測定空白脂質(zhì)體混懸液的粒度分布及多分散系數(shù)(PDI)，考察水化溫度對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑的影響。見圖1。

結(jié)果表明，溫度為45，50 ℃條件下水化磷脂膜，制得的空白脂質(zhì)體初品經(jīng)脂質(zhì)體擠出器擠出后，所得到的空白脂質(zhì)體粒徑較大；而當(dāng)制備溫度升至55 ℃時(shí)，制備得到的空白脂質(zhì)體粒徑較適中；再升高溫度，制備得到的空白脂質(zhì)體粒徑有一定程度降低，考慮到大豆磷脂在高溫條件下不穩(wěn)定[4]，選擇水化磷脂膜溫度度為55 ℃，而且本品所用大豆磷脂的相變溫度在約50 ℃，脂質(zhì)體也應(yīng)在高于其相變溫度條件下制備，故確定制備空白脂質(zhì)體的溫度為55 ℃。

圖1 水化溫度對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑的影響

Fig.1 Effect of hydration temperature on particle size of blank liposomes

2.4.1.2 擠出次數(shù)對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑的影響 脂質(zhì)體粒徑大小及分布對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性有一定影響。本實(shí)驗(yàn)通過控制均質(zhì)壓力及均質(zhì)次數(shù)，進(jìn)一步通過擠出儀減小脂質(zhì)體粒徑，使脂質(zhì)體產(chǎn)品粒徑小而分布均勻。按照“2.2”項(xiàng)下制備空白脂質(zhì)體，通過脂質(zhì)體擠出儀，通過孔徑為0.22 μm微孔濾膜擠出1，2，3，4，5次、0.08 μm微孔濾膜擠出1，2，3，4，5，6，7，8次時(shí)分別取樣測定樣品粒徑，考察擠出次數(shù)對(duì)空白脂質(zhì)體粒徑的影響。見圖2，3。

圖2 空白脂質(zhì)體初品經(jīng)脂質(zhì)體擠出器(0.22 μm)擠出次數(shù)對(duì)粒徑的影響

Fig.2 Effect of extrusion times (0.22 μm) on particle size of the preliminary blank liposomes

結(jié)果表明，空白脂質(zhì)體初品經(jīng)過孔徑0.22 μm濾膜擠出3次和孔徑0.08 μm濾膜擠出5次后粒徑不再減小，故確定擠出先過孔徑0.22 μm濾膜擠出3次，再過孔徑0.08 μm濾膜擠出5次。

2.4.2 載藥長循環(huán)脂質(zhì)體制備工藝考察

2.4.2.1 孵化溫度對(duì)包封率、粒徑的影響 將制備好的空白脂質(zhì)體分別采用45，50，55，60和65 ℃的孵化溫度孵化30 min后，制備載藥脂質(zhì)體，載藥后不濃縮，以包封率、粒徑為指標(biāo)考察對(duì)工藝的影響，考察孵化溫度對(duì)包封率、粒徑的影響。見圖4。

圖3 空白脂質(zhì)體經(jīng)脂質(zhì)體擠出器(0.08 μm)擠出次數(shù)對(duì)粒徑的影響

Fig.3 Effect of extrusion times (0.08 μm) on particle size of the preliminary blank liposomes

圖4 孵化溫度對(duì)脂質(zhì)體包封率、粒徑的影響

Fig.4 Effect of incubation temperature on particle size and encapsulation efficiency of liposomes

結(jié)果表明，當(dāng)孵化溫度為45 ℃時(shí)包封率很低，而當(dāng)孵化溫度升高至50 ℃時(shí)包封率提高到80%，孵化溫度提高到55 ℃時(shí)包封率93.4%，溫度升到60 ℃時(shí)包封率不再明顯提高；孵化溫度的變化對(duì)粒徑無明顯影響。故確定載藥孵化溫度為55 ℃，可以保證藥物最大限度的裝載。

2.4.2.2 孵化時(shí)間對(duì)包封率、粒徑的影響 固定其他工藝因素不變，分別采用5，10，20，30，45，60 min的孵化時(shí)間制備脂質(zhì)體。載藥后不濃縮，以包封率、粒徑為指標(biāo)考察對(duì)工藝的影響，考察孵化時(shí)間對(duì)包封率、粒徑的影響。見圖5。

結(jié)果表明，孵化時(shí)間對(duì)樣品包封率有一定影響，孵化時(shí)間為10 min時(shí)包封率可以達(dá)到80%，表明藥物的裝載速度比較快，當(dāng)孵化時(shí)間提高到30 min時(shí)包封率又提高至95.1%， 而孵化時(shí)間延長至60 min時(shí)包封率幾乎不變。孵化時(shí)間對(duì)粒徑無明顯影響。故確定孵化育時(shí)間為30 min較為合適。

圖5 孵化時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率、粒徑的影響

Fig.5 Effect of incubation time on particle size and encapsulation efficiency of liposomes

2.5 長循環(huán)脂質(zhì)體制備工藝驗(yàn)證與表征

2.5.1 長循環(huán)脂質(zhì)體粒徑分布及Zeta電位測定 按照“2.2”項(xiàng)下制備脂質(zhì)體方法制備3批Vin-B長循環(huán)脂質(zhì)體，以驗(yàn)證所篩選的制備工藝可行性。采用Mastersizer 2000 粒度分析儀測定長循環(huán)脂質(zhì)體的粒徑分布；Zetasizer Nano 電位分析儀測定Zeta電位。見圖6。

圖6 長循環(huán)脂質(zhì)體粒徑分布及Zeta電位

Fig.6 Size distribution and zeta potential of Vin-B long-circulation liposomes

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，長循環(huán)脂質(zhì)體平均粒徑(96.4±27.2) nm，PdI為(0.162±0.042)，說明長循環(huán)脂質(zhì)體粒徑分布較均勻；Zeta電位為(-26.7±3.5) mV，說明長循環(huán)脂質(zhì)體表面荷負(fù)電，微粒間的靜電排斥提高了長循環(huán)脂質(zhì)體的分散性，有助于脂質(zhì)體穩(wěn)定[7]。

2.5.2 長循環(huán)脂質(zhì)體透射電鏡觀察 采用磷鎢酸負(fù)染法制備透射電鏡樣品。將樣品稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取適量滴于火棉膠作為支持膜的銅網(wǎng)上，浸泡于2%磷鎢酸溶液(氫氧化鈉調(diào)至pH7.0)中染色2～5 min。待銅網(wǎng)烘干后用透射電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài)。見圖7。

圖7 長循環(huán)脂質(zhì)體透射電鏡照片

透射電鏡照片顯示，可清晰看到脂質(zhì)體雙層結(jié)構(gòu)明顯，粒子大小分布較均勻，未見脂質(zhì)體聚集，粒徑大小與Mastersizer 2000 粒度分析儀測定結(jié)果一致。

2.6 長循環(huán)脂質(zhì)體體外釋放行為考察 采用透析法[8]考察長循環(huán)脂質(zhì)體在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS，pH7.4)中的釋放行為。操作如下：精密吸取重酒石酸長春瑞濱長循環(huán)脂質(zhì)體溶液2.0 mL，置于處理好的透析袋內(nèi)(截留相對(duì)分子質(zhì)量：8 000～14 000)，平行3份，扎緊后置于溶出儀的漿葉底部；同法吸取Vin-B溶液(1.5 mg·mL-1)2.0 mL置于處理好的透析袋內(nèi)，平行3份。移取釋放介質(zhì)100 mL于溶出儀的小杯中，溫度(37.0±0.5) ℃，轉(zhuǎn)速(50±1) r·min-1，分別于0.1，0.15，0.33，0.5，0.75，1，2，4，6，8，12，16，24 h吸取釋放介質(zhì)1 mL(同時(shí)補(bǔ)加等量、同溫的釋放介質(zhì))，采用“2.1.1”項(xiàng)下測定Vin-B的含量，并計(jì)算藥物的累計(jì)釋放度。見圖8。

圖8 Vin-B溶液和長循環(huán)脂質(zhì)體體外釋放曲線(n=3)

Fig.8Invitrorelease curves of Vin-B long-circulation liposomes and Vin-B solutions

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長循環(huán)脂質(zhì)體中Vin-B釋放緩慢，原因可能是由于脂質(zhì)雙分子層中的膽固醇對(duì)磷脂膜起到了穩(wěn)定的作用，可減緩藥物從膜內(nèi)向膜外釋放。

2.7 穩(wěn)定性考察 將長循環(huán)脂質(zhì)體放置在室溫(25 ℃)和低溫(5 ℃)條件下3個(gè)月，分別在0.5，1，2，3個(gè)月取樣檢測樣品的平均粒徑、PdI和Zeta電位，考察長循環(huán)脂質(zhì)的穩(wěn)定性。見表2。

表2 長循環(huán)脂質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

…樣品在西林瓶底部形成絮狀沉淀，未進(jìn)行測定

Flocculent precipitates were formed at the bottom of the samples vials and the samples were not measured

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長循環(huán)脂質(zhì)在室溫(25 ℃)條件下放置2周后，粒徑明顯變大，當(dāng)放置2個(gè)月后，在西林瓶底部形成絮狀沉淀，說明長循環(huán)脂質(zhì)不適合放置在室溫(25 ℃)條件下；而長循環(huán)脂質(zhì)在低溫(5 ℃)條件下放置3個(gè)月，平均粒徑、PdI 及Zeta電位基本未發(fā)生變化，說明長循環(huán)脂質(zhì)在低溫(5 ℃)條件下放置可提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道的Vin-B長循環(huán)脂質(zhì)體采用的有pH梯度法[3]和離子載體A23187介導(dǎo)pH的梯度法[5]。第一種方法外水相采用氫氧化鈉調(diào)節(jié)脂質(zhì)體外水相pH，但氫氧化鈉的強(qiáng)堿性對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性有一定影響；第二種方法采用離子載體介導(dǎo)，但是載體難以分離除去。筆者在這些報(bào)道基礎(chǔ)上，將外水相改用磷酸鈉溶液，堿性相對(duì)溫和且具有一定的緩沖能力。

PEG鏈的長度和相對(duì)分子質(zhì)量與脂質(zhì)體的穩(wěn)定性關(guān)系密切，一般而言，PEG鏈越長(相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)5 000)，脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間越長；但對(duì)于膠態(tài)脂質(zhì)體，相對(duì)分子質(zhì)量在1 000～2 000之間的PEG長循環(huán)效果最好。因此，本實(shí)驗(yàn)選用PEG2000-DSPE作為長循環(huán)材料制備長循環(huán)脂質(zhì)體。

包封率是衡量脂質(zhì)體質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)。葡聚糖凝膠柱層析法是較常用的方法，運(yùn)用分子篩效應(yīng)分離大小不同的物質(zhì)，但是此法不適用于脂溶性藥物；另外，由于葡聚糖表面許多位點(diǎn)能與脂質(zhì)體膜結(jié)合并相互作用，引起部分脂質(zhì)丟失，導(dǎo)致膜滲透性的改變及包裹物質(zhì)的滲漏且脂質(zhì)體易被稀釋。而超濾法存在回收率低等問題，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)重酒石酸長春瑞濱在不同濃度條件下回收率都低于90%，不符合方法學(xué)要求。經(jīng)過多次預(yù)試驗(yàn)，筆者在本實(shí)驗(yàn)中最終采用低溫超速離心法測定脂質(zhì)體的包封率，該方法方便快速，且容易操作。

體外釋放研究結(jié)果表明，Vin-B溶液在2 h內(nèi)釋放百分率為100%，說明2 h左右透析袋內(nèi)外藥物濃度即可達(dá)到平衡。Vin-B長循環(huán)脂質(zhì)體在PBS中釋放較平緩，24 h累計(jì)釋放百分率58.4%，表明Vin-B長循環(huán)脂質(zhì)體有延緩藥物釋放的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步體內(nèi)研究打下了基礎(chǔ)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.03.026

Preparation and Characterization of Vinorelbine Bitartrate Long-circulation Liposome

XIE Xiangyang1， CHEN Chen1， LIN Wen2， LI Yinke1，LI Yang1，CHEN Ying1

(1.DepartmentofPharmacy，WuhanGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand，Wuhan430070，China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory，HuangshiAikangHospitalofHubeiProvince，Huangshi435000，China)

Objective To prepare vinorelbine bitartrate long-circulation liposomes by pH gradient loading methods and make characterization. Methods The impact of hydration temperature and extrusion times on the blank liposome particle size was investigated;and the incubation temperature and in duration on size and encapsulation percentage of drug loading liposome particle was tested.The vinorelbine bitartrate long-circulation liposome was characterized for particle size，polydispersion index，Zeta potential，morphology，and was studied for long term stability. Results The particle size，Zeta potential，polydispersion index of long-circulation liposomes were (96.4±27.2) nm，(0.162±0.042)，(-26.7±3.5) mV，respectively.The liposomes were small，unilamellar and spherical with smooth surface under transmission electron microscopy.Long term stability studies showed that the liposomes were stable for up to 3 months after storage at 5 ℃. Conclusion The preparation technology for the vinorelbine bitartrate long-circulation liposome by pH gradient loading methods is feasible.

Vinorelbine, bitartrate; Liposome,long-circulation; pH Gradient loading methods

2014-03-10

2014-04-12

謝向陽(1982-)，男，湖南汨羅人，主管藥師，碩士，研究方向：醫(yī)院制劑研究與開發(fā)。電話：027-87649309，E-mail：xxy5727035@163.com。

陳鷹(1972-)，女，安徽金寨人，副主任藥師，博士，研究方向：藥物新劑型與新技術(shù)。電話：027-87649309，E-mail：cy9262005@qq.com。

R979.1；TQ450.1

B

1004-0781(2015)03-0379-06