鄒成林，陳維鈞，孫曉順，方璟，涂軍，趙亞洲

(湖北省荊州市第二人民醫(yī)院內(nèi)一科，荊州 434000)

促血小板生成素對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷后JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響

鄒成林，陳維鈞，孫曉順，方璟，涂軍，趙亞洲

(湖北省荊州市第二人民醫(yī)院內(nèi)一科，荊州 434000)

目的 探討促血小板生成素(TPO)對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制。方法 采用大腦中動(dòng)脈線栓法制作大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型。將80只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，分別為假手術(shù)組、模型對照組、TPO組、TPO+蛋白質(zhì)酪氨酸激酶抑制藥(AG490)組。于缺血-再灌注前30 min，TPO組給予5 μg·kg-1TPO腹腔注射，TPO+ AG490組于缺血-再灌注前30 min先腹腔內(nèi)注射5 μg·kg-1TPO，再給予8 μg·kg-1AG490腹腔注射，模型對照組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液。再灌注6，12，24，48 h后處死取腦組織、切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色、免疫組化染色、Western blotting和細(xì)胞凋亡檢測。結(jié)果 與模型對照組比較，缺血-再灌注24 h后TPO組細(xì)胞凋亡數(shù)減少[(67.50±9.37)比(40.20±7.47)個(gè)]，Bcl-2、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2(JAK2)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)蛋白表達(dá)水平升高，分別為(35.40±7.39)比(78.70±9.75)，(35.68±6.75)比(62.35±7.53)，(25.40±9.45)比(55.36±9.69)，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與TPO組比較，TPO+AG490組Bcl-2、JAK2及STAT3蛋白表達(dá)水平降低，分別為(78.70±9.75)比(55.40±9.35)，(62.35±7.53)比(40.68±5.89)，(55.36±9.69)比(30.40±9.39)，細(xì)胞凋亡數(shù)增多[(40.20±7.47)比(55.23±7.65)個(gè)]，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 TPO可降低缺血-再灌注所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上調(diào)Bcl-2有關(guān)。

促血小板生成素；大鼠；損傷，缺血-再灌注；細(xì)胞凋亡；蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2與轉(zhuǎn)導(dǎo)激活因子3；Bcl-2

蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2與轉(zhuǎn)導(dǎo)激活因子3(Janus kinase 2 and signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)途徑廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過程。近年研究表明，JAK2/STAT3途徑參與腦缺血的病理過程，但該途徑的激活與缺血導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞存活及凋亡之間的具體關(guān)系尚不十分清楚，對其在腦缺血中的作用結(jié)論不一。促血小板生成素(thrombopoietin，TPO)是重要的造血生長因子，主要調(diào)控巨核細(xì)胞的增殖和血小板生成，其通過與細(xì)胞膜上的TPO受體(TPO-R，C-mpl)結(jié)合，形成同源二聚體，激活與之結(jié)合的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(Janus kinase 2，JAK2)，引起受體胞內(nèi)區(qū)酪氨酸殘基的磷酸化，從而激活下游STAT、 磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。楊默等[1]首次證實(shí)神經(jīng)系統(tǒng)中存在TPO受體(C-mpl)，能促經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞生長，對抗細(xì)胞凋亡。夏文杰等[2]在對體外TPO的神經(jīng)保護(hù)作用的研究中發(fā)現(xiàn)TPO通過激活神經(jīng)細(xì)胞PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)信號(hào)通路，拮抗細(xì)胞凋亡，具有保護(hù)神經(jīng)祖細(xì)胞C17.2的作用。TPO是否通過激活JAK2/STAT3途徑參與腦缺血的病理過程，其機(jī)制尚不十分明確。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠80只，體質(zhì)量250～290 g，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：4200600335，許可證號(hào)：SCXK[鄂]2011-0007，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物級(jí)別：SPF。動(dòng)物以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食水，光照12 h，黑暗12 h，室溫20～26 ℃條件下飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑 磷酸化JAK2多克隆抗體(批號(hào)：K0303)、磷酸化STAT3單克隆抗體(批號(hào)：C1303)、小鼠抗Bcl-2單克隆抗體(一抗)(批號(hào)：G2804)均購自Santa Cruz，CA公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/兔抗小鼠IgG及Western blotting檢測試劑盒(美國Upstate Biotechnology，InC，批號(hào)：lotL1609)，小鼠抗大鼠β-actin抗體(批號(hào)：20070711)、10%水合氯醛(批號(hào)：071219)、SABC試劑盒(批號(hào)：SA1025)、DAB顯色劑(批號(hào)：41281194)均購自武漢博士德生物工程有限公司，原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測試劑盒(北京中杉公司，批號(hào)：10490800)，重組人血小板生成素注射液(沈陽三生制藥股份有限公司，批號(hào)：S20050049)，蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2抑制藥AG490(Janus kinase 2 inhibitor AG490，碧云天生物科技有限公司，批號(hào)：116K1482)。

1.3 主要儀器與設(shè)備 PE9700型PCR儀(美國PE公司)，PowerPac型電泳儀(美國BioRad公司)，DYCP-31B型瓊脂糖水平電泳槽(北京六一儀器廠)，2000型凝膠成像分析系統(tǒng)(東勝公司)，CX31-72C02型實(shí)體顯微鏡(奧林巴斯)，Metamorph Imaging SystemV4.6計(jì)算機(jī)圖像分析軟件(美國UIC公司)。

1.4 動(dòng)物模型及制備 采用LONGA等[3]的大腦中動(dòng)脈線栓法制備大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型對照組、TPO組、TPO+AG490組(各20只)，觀察時(shí)間點(diǎn)為缺血-再灌注后6，12，24，48 h。于缺血-再灌注前30 min，TPO組給予TPO 5 μg·kg-1腹腔注射，TPO+ AG490組于缺血-再灌注前30 min先腹腔內(nèi)注射TPO 5 μg·kg-1；再給予AG490 8 μg·kg-1腹腔注射；模型對照組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液；假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行缺血-再灌注處理。

1.5 免疫組化染色檢測JAK2、STAT3及Bcl-2蛋白表達(dá) 4組大鼠至指定時(shí)間點(diǎn)處死后取腦組織，常規(guī)固定、石蠟包埋、切片，進(jìn)行SABC法免疫組化染色。胞質(zhì)有棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。每張切片在缺血區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野(×400)中的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值為JAK2、STAT3、Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)。

1.6 Western blotting法檢測蛋白表達(dá)量 磷酸化JAK2、STAT3及Bcl-2蛋白表達(dá)Western blotting檢測按照說明書操作。4組大鼠至指定時(shí)間點(diǎn)處死后取腦組織，在冰上分離缺血側(cè)大腦組織，勻漿，提取蛋白，蛋白定量，用化學(xué)發(fā)光法記錄結(jié)果。蛋白條帶進(jìn)行相對密度掃描并分析，計(jì)算各條帶的灰度值，以內(nèi)參照β-actin校正后的灰度值比值表示蛋白表達(dá)量。

1.7 TUNEL原位凋亡染色法檢測細(xì)胞凋亡 按照原位TUNEL試劑盒說明書操作。結(jié)果判定：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。每張切片在缺血區(qū)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野(×400)中的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值為該切片凋亡細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 腦組織蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色檢查 模型對照組缺血2 h再灌注24 h后，大鼠缺血側(cè)大腦半球明顯腫脹，TPO組腫脹較輕。腦組織切片HE染色顯示：假手術(shù)組皮質(zhì)無壞死細(xì)胞，神經(jīng)元數(shù)量多；模型對照組皮質(zhì)缺血中心神經(jīng)元數(shù)量稀疏，可見大量變性及壞死的神經(jīng)細(xì)胞；TPO組缺血中心區(qū)變小，邊緣區(qū)神經(jīng)細(xì)胞變性壞死減少，多數(shù)存活細(xì)胞形態(tài)相對正常；TPO+AG490組缺血中心區(qū)較TPO組大，邊緣壞死細(xì)胞多。

2.2 原位細(xì)胞凋亡檢測 模型對照組缺血側(cè)可見較多的陽性細(xì)胞，以缺血-再灌注24 h后最明顯；假手術(shù)組偶見個(gè)別陽性細(xì)胞；TPO組及TPO+AG490組缺血區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)目減少，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TPO+AG490組缺血區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)目較TPO組增加，與TPO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠缺血-再灌注24 h凋亡細(xì)胞數(shù)的比較

與模型對照組比較，*1P<0.05；與TPO組比較，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.05；compared with TPO group，*2P<0.05

2.3 腦組織免疫組化染色檢測 陽性細(xì)胞主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)/胞膜有棕黃色物質(zhì)沉積為陽性細(xì)胞。模型對照組大鼠缺血周邊區(qū)可見較多陽性細(xì)胞表達(dá)，與假手術(shù)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型對照組、TPO組、TPO+AG490組大鼠再灌注6 h時(shí)Bcl-2、JAK2、STAT3表達(dá)增強(qiáng)，24 h達(dá)峰值，之后表達(dá)出現(xiàn)下降。與模型對照組比較，TPO組各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、JAK2、STAT3陽性細(xì)胞均明顯增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與TPO組比較，TPO+ AG490組各時(shí)間點(diǎn)陽性細(xì)胞數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4 腦缺血-再灌注損傷后腦組織P-JAK2、P-STAT3及Bcl-2 Western blotting檢測 假手術(shù)組未見明顯P-JAK2、P-STAT3、Bcl-2蛋白的表達(dá)，TPO組腦組織P-JAK2、P-STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增多，24 h達(dá)峰值，之后表達(dá)出現(xiàn)下降，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，TPO+AG490組P-JAK2、P-STAT3、Bcl-2蛋白的表達(dá)減少，與TPO組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖1。

3 討論

TPO是調(diào)節(jié)血小板和巨核細(xì)胞系最主要的造血生長因子[4]。研究發(fā)現(xiàn)，TPO不僅參與造血的調(diào)控，對神經(jīng)系統(tǒng)也具有保護(hù)作用，它們通過動(dòng)員骨髓的內(nèi)源性干細(xì)胞，或通過其抗凋亡作用，在神經(jīng)損傷中發(fā)揮一定的作用。TPO可通過減少基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metallopeptidase 9，MMP-9)的表達(dá)保護(hù)大腦和改善感覺運(yùn)動(dòng)功能[5]。同時(shí)陳美苑等[6]發(fā)現(xiàn)，外源性TPO能夠在腦缺血發(fā)生早期起到神經(jīng)保護(hù)的作用，減輕缺氧缺血導(dǎo)致的腦功能損傷，但其機(jī)制尚不明確。本研究采用TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，模型對照組缺血側(cè)可見較多的陽性細(xì)胞，而TPO組缺血區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)目減少，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示，TPO可能通過抑制細(xì)胞凋亡而減輕缺血-再灌注所致腦細(xì)胞損傷，但其是通過何種途徑，目前尚不十分清楚。

表2 4組大鼠腦缺血-再灌注損傷后各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2、JAK2、STAT3的表達(dá)

與模型對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*1P<0.05；與TPO組同時(shí)間點(diǎn)比較，*2P<0.05

Compared with model control group at same time point，*1P<0.05；compared with TPO group at same time point，*2P<0.05

表3 4組大鼠腦組織再灌注損傷后24 h P-JAK2、P-STAT3及Bcl-2蛋白相對表達(dá)量

組別P-JAK2P-STAT3Bcl-2假手術(shù)組 0 0 0模型對照組0.23±0.040.24±0.020.31±0.05TPO組0.89±0.06*10.87±0.03*10.73±0.08*1TPO+AG490組0.58±0.05*20.48±0.03*20.56±0.04*2

與模型對照組比較，*P<0.05；與TPO組比較，*2P<0.05

Compared with model control group，*1P<0.05；compared with TPO group，*2P<0.05

A.假手術(shù)組；B.TPO組；C.TPO+AG490組；D.模型對照組

圖1 4組大鼠腦組織再灌注損傷后24 h P-JAK2、P-STAT3及Bcl-2蛋白的表達(dá)Western blotting檢測結(jié)果

A.sham operation group；B.TPO group；C.TPO and JAK kinase inhibitor (AG490) group；D.model control group

Fig.1 Western blotting analysis on the protein expression of P-JAK2, P-STAT3 and Bcl-2 among four groups of rats 24 hours after cerebral ischemia reperfusion

本研究通過免疫組化檢測大鼠缺血側(cè)皮層JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，模型對照組、TPO組再灌注6 h時(shí)JAK2、STAT3表達(dá)增強(qiáng)，24 h達(dá)峰值，之后表達(dá)出現(xiàn)下降。同時(shí)本研究利用Western blotting方法檢測，結(jié)果顯示，在假手術(shù)組大鼠腦組織中未出現(xiàn)磷酸化JAK2及STAT3蛋白表達(dá)，腦缺血-再灌注損傷6 h缺血周邊區(qū)腦組織有少量磷酸化JAK2及STAT3蛋白表達(dá)，24 h達(dá)峰值。這與免疫組化法檢測JAK2及STAT3蛋白表達(dá)在時(shí)間動(dòng)態(tài)變化上呈一致性，提示腦缺血后JAK2、STAT3表達(dá)及活化在缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡中起一定的作用。SUZUKI等[7]研究結(jié)果顯示，大腦局部缺血-再灌注后缺血皮質(zhì)及紋狀體神經(jīng)元可檢測到磷酸化STAT3蛋白表達(dá)，且再灌注24 h磷酸化STAT3蛋白表達(dá)達(dá)峰值，此后隨再灌注時(shí)間延長磷酸化STAT3蛋白表達(dá)漸減少。而WEN等[8]用免疫蛋白印跡法研究雄性黑鼠局灶性腦缺血損傷后磷酸化STAT3表達(dá)變化，結(jié)果顯示，缺血周邊區(qū)磷酸化STAT3蛋白在腦缺血6 h顯著增加。這與本研究結(jié)果一致，但缺血-再灌注腦損傷引起JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活對神經(jīng)細(xì)胞的確切作用，目前還沒有一致的說法。

BROWN等[9]研究顯示在腦缺血后STAT1和STAT3表達(dá)上調(diào)，而在剔除STAT1基因后，則對腦缺血具有一定的保護(hù)作用。SATRIOTOMO等[10]研究顯示，腦缺血-再灌注損傷后磷酸化JAK2和STAT3蛋白在缺血半暗帶表達(dá)增強(qiáng)，并參與促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的死亡，利用STAT3小分子干擾RNA(siRNA)或JAK2抑制藥(AG490)能夠抑制腦缺血后磷酸化JAK2和磷酸化STAT3的表達(dá)，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，縮小腦梗死范圍。JUSTICIA等[11]也證實(shí)在腦卒中后JAK2/STAT3信號(hào)被激活，并參與神經(jīng)損傷的病理過程，加重腦卒中后進(jìn)一步的損傷。而BAKER等[12]在研究TPO對缺血-再灌注小鼠心肌的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，TPO對損傷的心肌細(xì)胞具有抗凋亡的保護(hù)作用，JAK2抑制藥(AG490)能使該保護(hù)作用消失。YAMASHITA等[13]利用IL-6受體單克隆抗體阻斷IL-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果顯示，小鼠在缺血皮質(zhì)半暗帶磷酸化STAT3表達(dá)顯著減少，神經(jīng)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，梗死面積增加，神經(jīng)功能缺損惡化。

本研究通過免疫組化及Western blotting方法檢測JAK2、STAT3、Bcl-2蛋白表達(dá)，與模型對照組比較，TPO組各時(shí)間點(diǎn)JAK2、STAT3及Bcl-2陽性細(xì)胞均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過person相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)TPO組Bcl-2蛋白表達(dá)與JAK2、STAT3蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)呈正相關(guān)，而當(dāng)給予JAK2抑制藥AG490后，JAK2、STAT3及Bcl-2蛋白表達(dá)減少，且細(xì)胞凋亡數(shù)增加，推測TPO可能通過激活JAK2/STAT3通路，上調(diào)Bcl-2而減少細(xì)胞凋亡。研究結(jié)果顯示，缺血預(yù)處理可以通過JAK2/STAT3信號(hào)通路活化STAT3，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2，下凋促凋亡基因Bax，促進(jìn)缺血后心肌收縮功能的恢復(fù)，減少心肌細(xì)胞凋亡和心肌梗死面積[14]。KANDA等[15]研究顯示磷酸化STAT3(p-STAT3)可作用于細(xì)胞核內(nèi)特異的DNA結(jié)合位點(diǎn)，直接或間接地上調(diào)抑制凋亡基因如Bcl-2、Bcl-XL等表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡。

綜上所述，TPO是否通過激活JAK2/STAT3途徑，上調(diào)Bcl-2，減輕腦細(xì)胞凋亡，在腦缺血中與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間是否有交叉作用等均還未研究清楚，此外該途徑與腦缺血后神經(jīng)元發(fā)生和分化之間是否存在關(guān)聯(lián)也有待進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.008

Influence of Thrombopoietin on JAK2/STAT3 Signal Transduction Pathway in Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury of Rats

ZOU Chenglin, CHEN Weijun, SUN Xiaoshun, FANG Jing, TU Jun, ZHAO Yazhou

(DepartmentofInternalMedicine,theSecondPeople'sHospitalofJingzhou,HubeiProvince,Jingzhou434000,China)

Objective To investigate protective effects of thrombopoietin (TPO) on cerebral model control in rats and associated signal transduction pathway. Methods Thread embolism was performed to generate cerebral ischemia-reperfusion rat model.Eighty male SD rats were randomly divided into sham operation group, model control group, TPO group, TPO and Janus kinase inhibitor (AG490) group.Before 30 min of ischemia-reperfusion, TPO group was given TPO (5 μg·kg-1) by intraperitoneal injection, TPO + AG490 group was given TPO (5 μg·kg-1) before 30 min of ischemia reperfusion, then given AG490 (8 μg·kg-1), and model control group were given the same dose of 0.9% sodium chloride solution.The observation time points were 6, 12, 24, and 48 h after ischemia reperfusion.Immunohistochemical staining and Western blotting were used to measure the protein levels of Bcl-2, JAK2 and signal transducer & activator of transcription (STAT3).TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL) was used to detect apoptosis. Results Compared with model control group, the number of apoptotic cells were significantly reduced [(67.50±9.37)vs.(40.20±7.47)], the expression levels of Bcl-2, JAK2 and STAT3 protein were significantly increased [(35.40±7.39)vs.(78.70±9.75)； (35.68±6.75)vs.(62.35±7.53)； (25.40±9.45)vs.(55.36±9.69), respectively] 24 h after ischeia reperfusion in the TPO group (allP<0.05).Compared with the TPO group, the Bcl-2, JAK2 and STAT3 protein levels were significantly decreased in TPO and AG490 group [(78.70±9.75)vs.(55.40±9.35)； (62.35±7.53)vs.(40.68±5.89)； (55.36±9.69)vs.(30.40±9.39), respetively], and the number of apoptotic cells was significantly increased [(40.20±7.47)vs.(55.23±7.65)] (allP<0.05). Conclusion TPO can inhibit cell apoptosis after ischemia-reperfusion injury, the mechanism might be related to the activation of JAK2/STAT3 signal transduction pathway through raising the expression of Bcl-2 gene.

Thrombopoietin；Rats；Injury, ischemia-reperfusion；Apoptosis；Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription；Bcl-2

2014-07-25

2014-10-13

鄒成林(1981-)，湖北宜昌人，男，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：腦血管疾病發(fā)病機(jī)制及治療。電話：0716-8223833，E-mail：38716711@qq.com。

R973.6； R965

A

1004-0781(2015)08-1019-05