張曉雪，賈俊婷，羅攀，陳誠，郭蓮軍

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430033；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，武漢 430030)

可樂定對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪損傷的保護(hù)作用

張曉雪1，賈俊婷2，羅攀2，陳誠2，郭蓮軍2

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430033；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，武漢 430030)

目的 研究可樂定對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元氧糖剝奪(OGD)損傷的保護(hù)作用。方法 取培養(yǎng)8 d的皮質(zhì)神經(jīng)元，分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、可樂定(1.0，3.0，10.0 μmol·L-1)預(yù)處理組。神經(jīng)元氧糖剝脫損傷模型通過化學(xué)性缺氧、孵育液缺糖的方法建立。神經(jīng)元損傷程度采用噻唑藍(lán)(MTT)染色法和檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量來進(jìn)行評(píng)價(jià)，觀察預(yù)給予可樂定(1.0，3.0，10.0 μmol·L-1)對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。結(jié)果 顯微鏡下，正常對(duì)照組細(xì)胞密集，胞體飽滿，邊緣光滑，有較強(qiáng)折光性；神經(jīng)元存活率(100.00±32.12)%，LDH釋放比率(100.00±37.51)%。模型對(duì)照組細(xì)胞核固縮，細(xì)胞膜不完整，折光性差，MTT染色吸光度值明顯降低，神經(jīng)元存活率(53.61±7.62)%，LDH釋放量顯著增加，釋放率為(166.07±9.65)%?？蓸范?1.0，3.0，10 μmol·L-1)預(yù)處理可明顯逆轉(zhuǎn)ODG損傷所致細(xì)胞形態(tài)的改變，劑量依耐性升高M(jìn)TT染色吸光度值，神經(jīng)元存活率分別為(67.53±10.54)%，(71.50±9.79)%和(87.48±5.29)%，同時(shí)可明顯降低LDH的釋放量，釋放率分別為(136.45±25.72)%，(130.92±24.94)%和(121.63±32.68)%。結(jié)論 可樂定對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元ODG損傷具有良好的保護(hù)作用。

可樂定；皮質(zhì)神經(jīng)元；原代培養(yǎng)；損傷，氧糖剝奪

20世紀(jì)70年代，可樂定作為α2腎上腺素受體激動(dòng)藥成功應(yīng)用于治療高血壓。但隨后一些療效好、不良反應(yīng)少的降壓藥的出現(xiàn)，使得可樂定現(xiàn)已很少用于高血壓的治療，而較多用作麻醉輔助藥及鎮(zhèn)痛藥，以及阿片類藥物依賴的脫毒治療[1-2]。最近發(fā)現(xiàn)，一種新型的α2腎上腺素受體激動(dòng)藥鹽酸右美托咪啶(dexmedetomidine，DEX)，系統(tǒng)給藥對(duì)腦缺血引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用[3]，同時(shí)可拮抗麻醉藥氯胺酮、異氟烷等引起的神經(jīng)凋亡和海馬損傷[4-5]。在成人清醒開顱術(shù)中發(fā)現(xiàn)，DEX可抑制高碳酸血癥導(dǎo)致的腦血管擴(kuò)張而產(chǎn)生腦保護(hù)作用[6]。對(duì)此有關(guān)α2腎上腺素受體激動(dòng)藥對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用受到高度關(guān)注。以往有關(guān)可樂定神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)主要在整體腦缺血模型中展開，而在體外水平研究則較少報(bào)道[7]。為了深入了解可樂定在體外水平及氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation，OGD)情況下是否具有神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，筆者應(yīng)用大鼠原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，通過化學(xué)性缺氧缺糖即OGD損傷模型，進(jìn)一步評(píng)價(jià)可樂定對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，為該類藥物的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 1～3 d齡的斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)乳鼠，清潔級(jí)，合格證號(hào)：No：00020736，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)20100007。動(dòng)物房自然采光，室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度(50±10)%。常規(guī)飼料，自由飲食。

1.2 試劑 可樂定(clonidine，含量：>95%，批號(hào)：4205-91-8)粉劑，購自Sigma公司，臨用前用雙蒸水配成1.0，3.0，10.0 μmol·L-1的濃度，過濾除菌后備用，于4 ℃避光保存；連二亞硫酸鈉(批號(hào)：07032)購自南京化學(xué)試劑一廠；噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT，批號(hào)：M8180-1)購自Sigma公司；胎牛血清(批號(hào)：20091116)購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司，-20 ℃冰箱保存；胰酶(trypsin，批號(hào)：BE2189)，L-多聚賴氨酸(P1399)，阿糖胞苷(批號(hào)：w10562)均購自Sigma公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒，批號(hào)：GTX62716，購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

1.3 儀器 2306-2型二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(美國SHELLAB公司)；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；WV-GP460型光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(蘇州松下通信工業(yè)有限公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(德國Bioztek儀器公司)。

1.4 大鼠皮質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 用75%乙醇消毒后斷頭，分離顱骨，快速取腦，仔細(xì)剝離腦膜，分離大腦皮質(zhì)放入培養(yǎng)皿清洗兩次后置于青霉素瓶，加適量D-Hank's液，用眼科剪剪成大小0.8 mm3；轉(zhuǎn)移至刻度試管按1：1的比例加0.25%胰酶，吸管吹打混勻，37 ℃孵育15～20 min，待液體呈粘稠狀后，吸管吹打混勻，加入少許完全培養(yǎng)液終止消化，吸管吹打混勻；過濾，75 μm孔徑篩網(wǎng)過濾至燒杯轉(zhuǎn)移至刻度試管，加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液至10 mL，吸管吹打混勻，1 000 r·min-1(r=8 cm)離心10 min(重復(fù)兩次)；去上清液，加入適量完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整細(xì)胞密度至106個(gè)·mL-1，接種于預(yù)先用多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)板；第3天全量換液，第4天加阿糖胞苷(終濃度為5×10-3g·L-1)抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)，第5天全量換液，以后每隔1 d半量換液，或根據(jù)培養(yǎng)液顏色定期換液。

1.5 ODG模型制備與實(shí)驗(yàn)分組 取培養(yǎng)8 d的皮質(zhì)神經(jīng)元，利用拆信封法隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組和可樂定(1.0，3.0，10.0 μmol·L-1)預(yù)處理組，每組6孔(n=6)，重復(fù)3次?？蓸范ㄔ贠DG前24 h給予。上述各組孵育24 h后，正常對(duì)照組各孔分別加入200 μL含糖的Earle’s液，而模型對(duì)照組和給藥組各孔分別加入連二亞硫酸鈉濃度為2 mmol·L-1的無糖Earle’s液，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃，5%CO2，95%O2)孵育4 h后進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)[8-9]。

1.6 MTT還原實(shí)驗(yàn) 用于檢測(cè)神經(jīng)元的活力。OGD結(jié)束后，向接種細(xì)胞的96孔板中加入MTT(5 g·L-1，每孔200 μL)，培養(yǎng)箱(37 ℃，CO25%，O295%)孵育4 h。孵育結(jié)束后將上清去除，每孔加入二甲亞砜(DMSO)150 μL，氣浴震蕩儀震蕩10 min使深藍(lán)色甲臜充分溶解后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)570 nm處的吸光度(A)值。細(xì)胞存活率(%)=(測(cè)定組A570 nm-測(cè)定空白A570 nm)/(正常組A570 nm-測(cè)定空白A570 nm)×100%。

1.7 LDH釋放量的測(cè)定 作為細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志酶LDH是糖的無氧酵解和糖異生的重要酶系之一，其釋放量與細(xì)胞受損、膜通透性改變等密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)ODG損傷結(jié)束后，收集細(xì)胞孵育液，其中LDH的含量按照LDH試劑盒說明書進(jìn)行。檢測(cè)原理，LDH催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸再與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在堿性溶液中呈棕紅色，測(cè)定其在440 nm處A值，然后按公式計(jì)算LDH的含量，以百分率表示。LDH釋放量百分率(%)=各實(shí)驗(yàn)組LDH含量/正常組LDH含量×100%。

2 結(jié)果

2.1 可樂定對(duì)原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元OGD損傷的保護(hù)作用 正常對(duì)照組神經(jīng)元胞體飽滿，邊緣光滑，有較強(qiáng)折光性；模型對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，胞體膨脹甚至破裂，細(xì)胞膜不完整，折光性差。MTT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常對(duì)照組的神經(jīng)元存活百分率為(100.00±32.12)%，模型對(duì)照組神經(jīng)元存活百分率為(53.61±7.62)%。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組神經(jīng)元的存活率明顯降低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；可樂定1.0，3.0，10 μmol·L-1預(yù)處理組存活百分率分別為(67.53±10.54)%，(71.50±9.79)%，(87.48±5.29)%，與模型對(duì)照組比較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果見圖1，2。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.可樂定1.0 μmol·L-1預(yù)處理組；D.可樂定3.0 μmol·L-1預(yù)處理組；E.可樂定10.0 μmol·L-1預(yù)處理組；與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01，與模型對(duì)照組比較，*2P<0.01

圖1 5組原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)細(xì)胞活力的比較

A.normal control group；B.model control group；C.1.0 μmol·L-1clonidine pretreatment group；D.3.0 μmol·L-1clonidine pretreatment group；E.10.0 μmol·L-1clonidine pretreatment group；compared with normal control group，*1P<0.01； compared with model control group，*2P<0.01

Fig.1 Comparison of the activity among five groups of primary cultured rat cortical neurons

2.2 可樂定對(duì)OGD損傷的原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元

LDH釋放量的影響 正常對(duì)照組神經(jīng)元LDH釋放量百分率為(100.00±37.51)%，模型對(duì)照組為(166.07±9.65)%，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組釋放量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；可樂定(1.0，3.0，10.0 μmol·L-1)預(yù)處理LDH釋放量百分率分別為(136.45±25.72)%，(130.92±24.94)% 和(121.63±32.68)%，與模型對(duì)照組比較，釋放量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見圖3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞中加入連二亞硫酸鈉，同時(shí)用無糖培養(yǎng)液孵育4 h，即進(jìn)行OGD損傷，可見細(xì)胞數(shù)量明顯減少，MTTA值明顯減少，LDH釋放明顯增加。LDH是細(xì)胞內(nèi)糖的無氧酵解和糖異生的重要酶系之一，其釋放量與細(xì)胞受損、膜通透性改變等密切相關(guān)，OGD損傷后，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量增加，其增加程度與細(xì)胞受損程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的皮質(zhì)細(xì)胞在OGD的同時(shí)加入可樂定(1.0，3.0，10.0 μmol·L-1)均可以顯著逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元的損傷。顯微鏡下可見細(xì)胞密度明顯增加，劑量依耐性增加MTTA值和減少LDH釋放。證明可樂定對(duì)由OGD所致的原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元損傷有良好的保護(hù)作用。

α2腎上腺素受體廣泛分布于中樞神經(jīng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)節(jié)中，是一種跨膜性的G蛋白耦聯(lián)受體。在大腦多個(gè)腦區(qū)含有豐富的去甲腎上腺素能系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)選擇性的激動(dòng)藍(lán)斑核α2腎上腺素受體，能發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠效應(yīng)，作用于脊髓部位α2受體能產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。在整體動(dòng)物腦缺血模型中已經(jīng)報(bào)道α2受體激動(dòng)藥DEX能通過減少中樞交感神經(jīng)活性、降低循環(huán)中的兒茶酚胺濃度[10]，減少谷氨酸釋放及降低谷氨酸受體敏感性[11]，而發(fā)揮神經(jīng)保細(xì)胞的保護(hù)作用。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.可樂定10 μmol·L-1預(yù)處理組

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.可樂定1.0 μmol·L-1預(yù)處理組；D.可樂定3.0 μmol·L-1預(yù)處理組；E.可樂定10.0 μmol·L-1預(yù)處理組；與正常對(duì)照組比較，*1P<0.01，與模型對(duì)照組比較，*2P<0.05

圖3 5組原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元LDH釋放量的比較

A.normal control group；B.model control model group；C.1.0 μmol·L-1clonidine pretreatment group；D.3.0 μmol·L-1clonidine pretreatment group；E.10.0 μmol·L-1clonidine pretreatment group；compared with normal control group，*1P<0.01； compared with model control group，*2P<0.05

Fig.3 Comparison of LDH release among five groups of primary cultured rat cortical neurons

可樂定作為選擇性α2受體激動(dòng)藥亦能通過激活不同腦區(qū)α2受體，分別產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用。也有研究指出，可樂定激動(dòng)α2受體也可以影響谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞及兒茶酚胺類遞質(zhì)的釋放[12 -13]。所以，在本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞遭受OGD損傷時(shí)，可樂定可能是通過減少兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)。但有關(guān)可樂定對(duì)神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)的詳細(xì)機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.08.006

Neuroprotective Effect of Clonidine on Primary Cultured Cortical Neurons in Rats Subjected to Oxygen-glucose Deprivation Injury

ZHANG Xiaoxue1, JIA Junting2, LUO Pan2, CHEN Cheng2, GUO Lianjun2

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,Pu’aiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430033,China； 2.DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Objective To determine the neuroprotective effect of clonidine on primary cultured cortical neurons in rats exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD) injury. Methods Cortical neurons cultured for 8 days were randomly assigned to the three groups: normal control group, model control group, and clonidine pretreatment group.OGD injury model was established by chemical hypoxia and glucose deprivation in incubation liquid for 4 h.Clonidine (1.0, 3.0, 10 μmol·L-1) was added 24 h before OGD injury.Neuronal injury was evaluated by MTT staining and the release of lactate dehydrogenase (LDH). Results Under the microscope, primary cultured cortical neurons in normal control group presented great density, round size, smooth edge, and high diopter，The suvival rate of neurons and the percentage of LDH releasing were (100.00±32.12)% and (100.00±37.51)%, respectively.After exposure to OGD injury, cortical neurons showed karyopyknosis, incomplete cell membranes, low diopters and a significant reduction in optical density of MTT staining.In addition, the suvival rate of neurons and the percentage of LDH releasing were (53.61±7.62)% and (166.07±9.65)% separately compared with normal control group.In the group with pretreatment of different concentrations of clonidine (1.0, 3.0, 10 μmol·L-1), morphological changes induced by OGD injury were significantly reversed and optical density of MTT staining was dose-dependently raised.The percentages of survival neurons much higher than that of model control group were [(67.53±10.54)%, (71.50±9.79)% and (87.48±5.29)%, separately] and the obvious reductions of LDH releasing were [(136.45±25.72)%, (130.92±24.94)% and (121.63±32.68)%, respectively]. Conclusion Clonidine can exert neuroprotection against OGD-induced injury in primary cultured cortical neurons in rats.

Clonidine；Cortical neurons；Primary culture；Injury, oxygen-glucose deprivation

2014-06-17

2014-09-15

張曉雪(1984-)，女，甘肅蘭州人，博士，從事臨床檢驗(yàn)工作。電話：(0)13720231780，E-mail：1078953720@qq.com。

郭蓮軍(1953-)，女，湖北天門人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向： 心腦血管藥理。電話：027-83691763，E-mail： Ljguo@hust.edu.cn。

R977.15； R965

A

1004-0781(2015)08-1010-04

DOI 10.3870/yydb.2015.08.005