尤理想，趙 青，周 敏，汪意濤，吳淑燕，李嫄淵，黃 瑞

（蘇州大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇蘇州 215000）

細(xì)菌生物膜檢測(cè)方法改進(jìn)與應(yīng)用

尤理想，趙 青，周 敏，汪意濤，吳淑燕，李嫄淵，黃 瑞

（蘇州大學(xué)病原生物學(xué)系，江蘇蘇州 215000）

針對(duì)結(jié)晶紫染色法為細(xì)菌生物膜（biofilm，BF）檢測(cè)的經(jīng)典方法存在的不足，通過(guò)增加乙酸用量和減少洗菌次數(shù)等進(jìn)行改進(jìn)后，BF測(cè)定更為準(zhǔn)確。另嘗試采用多模式小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光菌的BF形成，并利用培養(yǎng)板和小圓玻片探究BF在不同載體上的形成情況，以?xún)?yōu)化小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)方法。用改進(jìn)后的2種方法摸索鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的最適濃度和時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種濃度為107CFU／mL、培養(yǎng)72h時(shí)檢測(cè)效果最佳。在BF檢測(cè)方法優(yōu)化的基礎(chǔ)上。探究鼠傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)BF形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒可促進(jìn)BF的形成。不同亞抑菌濃度雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1／4MIC（MIC為最小抑菌濃度）雙黃連對(duì)BF形成的抑制作用顯著低于1／2MIC和1／8MIC，表明雙黃連的抑菌作用與濃度不成正比關(guān)系，需嚴(yán)格控制臨床用藥劑量。

細(xì)菌生物膜；結(jié)晶紫染色；多模式小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)；鼠傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒；雙黃連

沙門(mén)菌（salmonella）主要經(jīng)水和食物傳播，可引起食物中毒、胃腸炎、傷寒和副傷寒等腸道疾病。鼠傷寒沙門(mén)菌（salmonella typhimurium）是最早被發(fā)現(xiàn)能引起大規(guī)模食物中毒的沙門(mén)菌之一，每年造成上億人發(fā)?。?－2］。細(xì)菌生物膜（biofilm，BF）是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附于惰性或活性材料表面而形成的一種與浮游細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)方式［3］，是由細(xì)菌及其產(chǎn)生的胞外多糖形成的特殊細(xì)菌群落。與浮游細(xì)菌相比，處于BF狀態(tài)下的細(xì)菌對(duì)不利條件如干燥、極端溫度、抗菌藥物以及消毒劑的抵抗力均明顯增強(qiáng)［4］，目前認(rèn)為99%的細(xì)菌以BF形式存在，65%～80%的人類(lèi)感染性疾病與BF有關(guān)［5］，成為臨床上難治性感染的重要原因之一［6］。鼠傷寒沙門(mén)菌作為臨床上常見(jiàn)的致病菌之一，其致病性和耐藥性與BF密切相關(guān)。由此可見(jiàn)，BF的研究對(duì)臨床疾病的診療具有十分重要的意義。結(jié)晶紫染色法是檢測(cè)BF的常用方法之一［7］，但在應(yīng)用過(guò)程中常出現(xiàn)生物膜脫落、丟失、不能完好保存等弊端，因此本研究對(duì)結(jié)晶紫染色方法進(jìn)行了優(yōu)化。此外，首次利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)對(duì)發(fā)光菌的生物膜檢測(cè)進(jìn)行了初步探索。在BF檢測(cè)方法和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，探究了鼠傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒與BF形成的關(guān)系，并檢測(cè)不同亞抑菌濃度雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的影響。

1 儀器

超凈工作臺(tái)（蘇州蘇凈集團(tuán)），生物安全柜（美國(guó)Baker公司），Allegra X－15R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman－Coulter公司），超低溫冰箱（日本Sanyo公司），多模式小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)DXS4000pro（美國(guó)柯達(dá)公司），96孔板和24孔板（美國(guó)Corning公司），酶標(biāo)儀MR450（美國(guó)Bio－Rad公司），721分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠(chǎng)）。

2 材料

（1）培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂、LB肉湯培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基，均為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)。

（2）試劑：無(wú)水乙醇、33%乙酸溶液、2%結(jié)晶紫溶液（上海國(guó)藥集團(tuán)），99%甲醇溶液（上海凌峰化學(xué)試劑公司），注射用雙黃連粉針劑（哈藥集團(tuán)）。

（3）受試菌：攜帶毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門(mén)菌野生株χ3306和質(zhì)粒消除株χ3337由美國(guó)亞利桑那州立大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院Roy Curtiss III教授惠贈(zèng)；含有細(xì)菌熒光素酶操縱子lux的質(zhì)粒pBEN276由法國(guó)自然資源研究所動(dòng)物傳染病和公共健康病原菌研究實(shí)驗(yàn)室Pierre Germon教授惠贈(zèng)。本文使用的菌株為實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的含pBEN276的發(fā)光菌χ3306lux和χ3337lux。

3 方法

3．1 細(xì)菌培養(yǎng)和定量

將保存于－80℃的受試菌接種至LB肉湯，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后轉(zhuǎn)移至血平板活化，分區(qū)劃線(xiàn)接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，分離純化單菌落后做生化和血清學(xué)鑒定。用接種環(huán)挑取單菌落3～5個(gè)，接種于LB肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)16～18h。2 500r／min離心10min，棄上清；生理鹽水（normal saline，NS）洗2次，棄上清；肉湯重懸。細(xì)菌定量方法參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行，分光光度計(jì)測(cè)受試菌液的吸光度OD600值，每次稀釋采用10－1級(jí)（即取0．5mL菌液加入4．5mL無(wú)菌NS）連續(xù)稀釋?zhuān){(diào)整菌液濃度，同時(shí)選取合適稀釋度做平板菌落計(jì)數(shù)。

3．2 檢測(cè)方法的改進(jìn)

3．2．1 結(jié)晶紫染色法改進(jìn)

結(jié)晶紫染色法參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行改進(jìn)。具體過(guò)程如下：將χ3306lux按200μL／孔加入96孔板，調(diào)整菌液終濃度為107CFU／mL，用封口膜密封后于30℃培養(yǎng)24h或72h；將板內(nèi)菌液吸棄，250μL NS洗2遍（原方法為3遍），每次洗菌后吸棄NS；加入200μL、99%甲醇固定15min，吸棄甲醇，室溫干燥；加入200 μL 2%結(jié)晶紫溶液染色5min，吸棄結(jié)晶紫染液，NS洗2遍，室溫干燥；加入220μL（原方法為200μL）33%乙酸溶解，混勻；酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570值。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

3．2．2 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)方法

將χ3306lux按1mL／孔加入24孔板，調(diào)整菌液終濃度為107CFU／mL，用封口膜密封后于30℃培養(yǎng)72h；將2板內(nèi)菌液吸棄，1．2mL NS洗2遍，每次洗菌后吸棄NS，將24孔板放入成像暗箱平臺(tái)，控制平臺(tái)升降至一個(gè)合適的視野，自動(dòng)關(guān)閉照明燈，在沒(méi)有外界光源的條件下（暗場(chǎng)）拍攝由發(fā)光菌發(fā)出的特異光子，記錄每孔光強(qiáng)度值。另一組在24孔板內(nèi)加入小圓玻片后再加入菌液培養(yǎng)，其余方法同上。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

3．3 BF形成適宜條件的測(cè)定

將χ3306lux按200μL／孔加入96孔板，或按1mL／孔加入24孔板，調(diào)整菌液終濃度為108、107、106、105、104CFU／mL，30℃培養(yǎng)24h或72h，用改進(jìn)后的結(jié)晶紫染色法和小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)測(cè)定BF。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

3．4 鼠傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)BF形成的影響

將χ3306lux和χ3337lux分別按200μL／孔加入96孔板，或1mL／孔加入24孔板，調(diào)整菌液終濃度為107CFU／mL，用封口膜密封后于30℃培養(yǎng)72h。用改良后的結(jié)晶紫染色法和小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)BF的形成。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

3．5 不同亞抑菌濃度雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的影響

3．5．1 鼠傷寒沙門(mén)菌最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

取無(wú)菌試管12支，第1管加入MH肉湯1．6 mL，其余每管加入1mL，在第1管加入雙黃連原液（1 280g／L）0．4mL，混勻后吸取1mL至第2管，混勻后再吸取1mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第11管，并從第11管中吸棄1mL；然后每管加入χ3306lux1mL，使菌液終濃度為5×105CFU／mL，此時(shí)第1管至第12管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0．5、0．25、0．125、0g／L；35℃培養(yǎng)20h后，以肉眼觀(guān)察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物濃度即為最小抑菌濃度MIC。選取1／2MIC、1／4MIC和1／8MIC作為不同亞抑菌濃度，用于以下實(shí)驗(yàn)。

3．5．2 不同亞抑菌濃度雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的影響

將χ3306lux按100μL／孔加入96孔板，將雙黃連按100μL／孔加入已有菌液的孔中，使菌液終濃度為107CFU／mL，雙黃連的終濃度分別調(diào)整為每孔1／2MIC、1／4MIC和1／8MIC，用封口膜密封后于30℃培養(yǎng)72h，通過(guò)結(jié)晶紫染色法與小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)各孔BF。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

4 結(jié)果

4．1 改進(jìn)后的結(jié)晶紫染色法測(cè)定結(jié)果

通過(guò)增加乙酸用量至220μL與減少洗菌次數(shù)至2次的優(yōu)化后，用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)BF。結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后測(cè)得的BF量較優(yōu)化前明顯增加，見(jiàn)表1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05），表明改良后的結(jié)晶紫染色法對(duì)BF量用吸光度OD570表征測(cè)定更為準(zhǔn)確。

表1 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)24h與72hBF形成情況

4．2 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)法改進(jìn)后測(cè)定結(jié)果

經(jīng)肉眼觀(guān)察，加小圓玻片組BF雖然浮起，仍完整性較好。經(jīng)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)測(cè)得加小圓玻片組的光強(qiáng)度顯著高于不加小圓玻片組，見(jiàn)圖1和圖2，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05），表明小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)可用于發(fā)光菌BF的檢測(cè)，加小圓玻片改良后檢測(cè)效果更佳。

4．2 BF形成條件的優(yōu)化

4．2．1 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)BF形成的最適濃度和時(shí)間

酶標(biāo)儀檢測(cè)不同時(shí)間和濃度下BF形成的OD570值見(jiàn)表2，結(jié)果顯示培養(yǎng)24h和72h2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，OD570值均在菌液濃度為107CFU／mL時(shí)最高（p＜0．05）；72h時(shí)各濃度菌液測(cè)得的OD570值均高于24h的相應(yīng)濃度（p＜0．05）。由此可見(jiàn)，接種細(xì)菌濃度為107CFU／mL、培養(yǎng)72h最有利于96孔板BF的形成。

圖1 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)加與不加小圓玻片BF形成情況

圖2 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)加與不加小圓玻片BF形成情況直方圖

表2 結(jié)晶紫染色檢測(cè)不同時(shí)間及細(xì)菌濃度下BF形成的OD570

4．2．2 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)24孔板BF形成的最適濃度

不同濃度下各24孔板光強(qiáng)度如表3和圖3所示。結(jié)果表明，接種細(xì)菌濃度107CFU／mL時(shí)，24孔板內(nèi)BF的平均光強(qiáng)度較其他接種濃度均高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05），故接種細(xì)菌濃度107CFU／mL為24孔板BF形成的最適濃度。

表3 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)24孔板BF形成的最適濃度

圖3 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)24孔板BF形成的最適濃度

4．2．3 小動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測(cè)24孔板BF形成的最適時(shí)間

按細(xì)菌接種最適濃度107CFU／mL鋪板，于30℃培養(yǎng)24、48、72h后，小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各24孔板平均光強(qiáng)度見(jiàn)表4。結(jié)果表明BF形成量在72h時(shí)最高，且與其余2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。因此24孔板BF形成的最適時(shí)間為培養(yǎng)72h。

表4 小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)24孔板在不同時(shí)間BF的形成情況

4．3 鼠傷寒沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)BF形成的影響

通過(guò)結(jié)晶紫染色法檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)菌χ3306lux和χ3337lux在96孔板上形成的BF，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)χ3306lux的OD570值顯著高于χ3337lux，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。經(jīng)小動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測(cè)24孔板BF結(jié)果（見(jiàn)圖4）顯示，χ3306lux組的光強(qiáng)度顯著高于χ3337lux組，與結(jié)晶紫染色法結(jié)果一致，即含毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門(mén)菌形成BF的能力比無(wú)質(zhì)粒菌強(qiáng)。

表5 結(jié)晶紫染色法測(cè)沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)BF形成的影響

4．4 不同亞抑菌濃度雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的影響

圖4 小動(dòng)物成像系統(tǒng)測(cè)沙門(mén)菌質(zhì)粒對(duì)BF形成的影響

通過(guò)MIC測(cè)定實(shí)驗(yàn)，得出雙黃連對(duì)χ3306lux的MIC為32g／L。用結(jié)晶紫染色法研究不同亞抑菌濃度雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的作用的結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，加入雙黃連組的BF形成量顯著低于不加藥組，1／4MIC組的OD570值明顯高于1／2MIC和1／8MIC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05），表明1／4MIC雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的抑制作用最小。小動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測(cè)24孔板BF形成結(jié)果（見(jiàn)圖5）顯示，1／4MIC組測(cè)得平均相對(duì)光強(qiáng)度最高，為22．403±1．374，1／2MIC組和1／8MIC組測(cè)得平均相對(duì)光強(qiáng)度分別為19．386±0．965和20．420±1．132，與結(jié)晶紫染色法一致，可見(jiàn)1／4MIC雙黃連濃度下BF形成量較其他組多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0．05）。

表6 結(jié)晶紫染色法測(cè)亞抑菌濃度雙黃連對(duì)BF形成的影響

5 討論

結(jié)晶紫染色法是一種簡(jiǎn)單、方便、準(zhǔn)確性相對(duì)較高、且應(yīng)用廣泛的方法。此方法的優(yōu)化對(duì)有關(guān)BF的研究具有重要意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，洗菌次數(shù)從3次改為2次后，BF損失降低；增加乙酸量至220μL可保證原氣液面位置的BF完全溶解，改良后有助于更好地保留BF，檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確。

小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)主要由CCD相機(jī)、成像暗箱、激光器、激發(fā)和發(fā)射濾光片、恒溫臺(tái)、氣體麻醉系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集的計(jì)算機(jī)及數(shù)據(jù)處理軟件等組成。生物發(fā)光成像是表達(dá)熒光素酶的活細(xì)胞與外源的熒光素反應(yīng)，在一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目成正比，具有特異性高、背景噪聲低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)使用的菌株帶有的質(zhì)粒pBEN276含熒光素酶基因操縱子luxCDABE，該基因是一種新型的報(bào)告基因，表達(dá)后產(chǎn)生熒光素酶及其底物，可發(fā)生特異作用而使其標(biāo)記的細(xì)菌持續(xù)發(fā)光。以該基因作為報(bào)告源的生物發(fā)光特異性極強(qiáng)，不需外加底物，具有極低的背景和極高的信噪比，將其插入細(xì)菌染色體中穩(wěn)定表達(dá)，可根據(jù)測(cè)得光信號(hào)水平直接得出發(fā)光細(xì)菌的相對(duì)數(shù)量，故導(dǎo)入質(zhì)粒pBEN276的鼠傷寒沙門(mén)菌χ3306lux和χ3337lux可采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。BF是由細(xì)菌及其產(chǎn)生的胞外多糖所形成的一種特殊細(xì)菌群落，可根據(jù)測(cè)得光信號(hào)水平直接觀(guān)測(cè)BF形成情況，本實(shí)驗(yàn)首次探索了利用小動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光菌BF的形成情況，結(jié)果證實(shí)該方法切實(shí)可行，可對(duì)BF形成情況進(jìn)行直接的定性和定量分析，具有簡(jiǎn)便、直觀(guān)的優(yōu)點(diǎn)，為BF相關(guān)研究方法提供了借鑒。另外，通過(guò)該法檢測(cè)在不同介質(zhì)上BF的形成情況，證明小圓玻片的加入可有效防止BF被沖洗脫落，并可保存BF完整性。

本研究通過(guò)優(yōu)化的結(jié)晶紫染色法和小動(dòng)物活體成像檢測(cè)法，測(cè)得BF在24孔板和96孔板形成的最適接種細(xì)菌濃度為107CFU／mL、最適培養(yǎng)時(shí)間為72h。結(jié)果表明，若接種濃度過(guò)高或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)菌可能由于營(yíng)養(yǎng)缺乏不利于BF形成；而接種濃度過(guò)低或培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，則可能由于無(wú)法達(dá)到BF形成的最佳菌量而影響B(tài)F形成。

BF與質(zhì)粒的影響是相互的［10］，一方面，BF可保護(hù)細(xì)菌中質(zhì)粒并影響其基因的表達(dá)，BF內(nèi)細(xì)菌對(duì)不利條件如干燥、極端溫度、抗菌藥物和消毒劑等抵抗力均明顯增強(qiáng)，且BF內(nèi)細(xì)菌代謝狀態(tài)不同，使細(xì)菌在任何狀態(tài)下都能存活一部分，能夠有效保存質(zhì)粒，BF中存在調(diào)控機(jī)制，能促進(jìn)質(zhì)粒基因的表達(dá)；另一方面，質(zhì)粒基因的表達(dá)也可影響B(tài)F的形成，包括促進(jìn)和抑制兩種作用。本文利用改進(jìn)后的結(jié)晶紫染色法與小動(dòng)物成像系統(tǒng)，探究了鼠傷寒沙門(mén)菌毒力質(zhì)粒對(duì)BF形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門(mén)菌形成BF的能力較強(qiáng)，推測(cè)鼠傷寒沙門(mén)菌質(zhì)?？纱龠M(jìn)BF的形成。

BF與臨床感染相關(guān)疾病密切相關(guān)，BF形態(tài)下細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性等與普通浮游生長(zhǎng)細(xì)菌顯著不同，且細(xì)菌在BF保護(hù)屏蔽下可逃避抗菌藥物殺傷作用和免疫細(xì)胞吞噬作用［11］。體外實(shí)驗(yàn)中，亞抑菌濃度抗菌藥物對(duì)BF形成的調(diào)控作用可隨抗菌藥物種類(lèi)、濃度、作用時(shí)間和菌種的不同而改變；同種抗菌藥物對(duì)同一種屬BF形成的影響，可因條件或菌株的差異呈現(xiàn)抑制或誘導(dǎo)等不同結(jié)果，且條件的改變會(huì)顯著影響B(tài)F的形成［12］，故亞抑菌濃度抗菌藥物的使用需十分謹(jǐn)慎。本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)優(yōu)化改良的結(jié)晶紫染色法與小動(dòng)物成像系統(tǒng)探究不同亞抑菌濃度雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的影響，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)1／4MIC雙黃連比1／2MIC和1／8MIC雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的抑制作用小，故可推測(cè)雙黃連對(duì)鼠傷寒沙門(mén)菌BF形成的抑制作用并非隨濃度增大而增強(qiáng)，提示雙黃連的抑菌作用與濃度不成正比，因此在臨床應(yīng)用過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格控制雙黃連的藥物濃度。

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·字義辨析·

象 與 像

象指自然界、人或物的形態(tài)、樣子，如：印象、表象、形象、現(xiàn)象、景象、函數(shù)圖象等。

像指用模仿、比較等方法制成的人或物的形象，包括由光線(xiàn)形成的與原物相同或相似的圖景，如：人像、攝像、畫(huà)像、肖像、影像、圖像、透鏡成像等。

《實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理》編輯部 編錄

Improved method of bacterial biofilm detection and its application

You Lixiang，Zhao Qing，Zhou Min，Wang Yitao，Wu Shuyan，Li Yuanyuan，Huang Rui
（Department of Microbiology，Soochow University，Suzhou 215000，China）

Crystal violet staining is a classical method for the detection of bacterial biofilm（BF），but remains deficiencies in mechanical process．In this study，the method is improved by increasing the amount of acetic acid and reducing washing times．The multi－mode small animal imaging system is used to detect the formation of luminous bacteria，using small circular glass and plastic plates to explore the formation of BF on different carriers to optimize the detection methods．By exploring the optimal concentration and culture time of Salmonella BF formation using the inmentioned improved detection methods，it is found that BF detected effect is the best when inoculating 107CFU／ml of bacteria and cultured for 72h．On the basis of the BF detection method optimization，this article explores the effects of Salmonella plasmid on biofilm formation，and the results show that the plasmid has a role in promoting BF formation．The experimental results of different sub－MIC of Shuanghuanglian on Salmonella BF formation show that 1／4MIC of Shuanghuanglian has the minimum inhibition effect to Salmonella BF formation compared with 1／2MIC and 1／8MIC of Shuanghuanglian，which hints at that the inhibition effect of Shuanghuanglian is not in direct proportion to its concentration and the dosage of clinical medicine needs to be strictly controlled．

bacterial biofilm；crystal violet staining；multi－mode small animal imaging system；salmonella typhimurium plasmid；shuanghuanglian

Q939．93

B

1002－4956（2015）3－0072－05

2014－07－29 修改日期：2014－09－11

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No．2011286）；江蘇省高等學(xué)校創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（No．2012yb017）

尤理想（1991—），男，江蘇連云港，臨床醫(yī)學(xué)七年制學(xué)生

吳淑燕（1972—），女，山東濰坊，博士，副教授，研究方向?yàn)榉肿游⑸飳W(xué)

通信作者：李嫄淵（1980—），女，江蘇蘇州，博士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)榉肿游⑸飳W(xué)．

E－mail：shuyanzw＠aliyun．com