柏 楊，李江濤，王 琳(.宜賓市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川 宜賓 644000；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液風(fēng)濕科，四川 成都 60050；.華西醫(yī)院皮膚科，四川 成都 60000)

轉(zhuǎn)化生長因子在銀屑病皮損組織中的表達(dá)研究

柏 楊1，2，李江濤1，王 琳3
(1.宜賓市第一人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川 宜賓 644000；2.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液風(fēng)濕科，四川 成都 610050；3.華西醫(yī)院皮膚科，四川 成都 610000)

目的 探討轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-beta l，TGF-β1)在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用，為銀屑病的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法測定58例銀屑病皮損組織(19例尋常型銀屑病、20例膿胞型銀屑病、19例紅皮病型銀屑病)皮損組織和10例正常皮膚組織TGF-β1的表達(dá)量，并進(jìn)行比較分析。結(jié)果 定位表達(dá)顯示：在正常皮膚組織中TGF-β1主要在表皮基底細(xì)胞中表達(dá)，表皮棘層及真皮中通常無表達(dá)或低表達(dá)；銀屑病皮損組織中TGF-β1在真皮乳頭層有明顯表達(dá)，表皮(包括基底層)中無表達(dá)或低表達(dá)。定量測定顯示，銀屑病皮損組織中IOD/area較正常皮損組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)；3種銀屑病皮損組織間TGF-β1表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。結(jié)論 TGF-β1表達(dá)異常可能在銀屑病發(fā)病機(jī)制中有重要作用。

轉(zhuǎn)化生長因子-β1；銀屑??；免疫組織化學(xué)；細(xì)胞因子

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的慢性、炎癥性疾病，主要臨床表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)鱗屑性紅斑或斑塊，還可伴有關(guān)節(jié)、心血管等其它系統(tǒng)損害。病情易反復(fù)，給患者生活帶來巨大困擾，明顯降低患者生活質(zhì)量。銀屑病的發(fā)生與發(fā)展受遺傳和環(huán)境因素雙重影響，發(fā)病機(jī)制目前還不完全清楚，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種細(xì)胞因子與之相關(guān)[1]，包括表皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-beta l，TGF-β1)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素(IL-6、IL-23)等。本研究采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)方法(SP法)檢測58例銀屑病患者皮損組織中TGF-β1表達(dá)，探討TGF-β1在銀屑病中的作用并為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 銀屑病皮損組織來源于2006～2013年在四川大學(xué)華西醫(yī)院和宜賓市第一人民醫(yī)院58例確診為銀屑病患者，包括19例尋常型銀屑病、20例膿胞型銀屑病、19例紅皮病型銀屑病皮損組織。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：均有典型或較為典型的皮損，并經(jīng)病理檢查證實(shí)符合銀屑病的組織病理改變，近3個(gè)月內(nèi)未服用過糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑，停止其他系統(tǒng)治療和光療法至少1個(gè)月，近3周內(nèi)皮損未進(jìn)行過局部治療，不伴有可能影像研究結(jié)果的重要疾病。正常皮膚組織10例均為我院骨科手術(shù)時(shí)修剪的殘余的四肢新鮮正常皮膚組織，包括表皮、真皮和皮下組織，大小為0.5 cm× 1.0 cm，局部無感染、出血、潰瘍、腫瘤等，且為不易經(jīng)常被摩擦處。正常皮膚組與銀屑病各亞組性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，具有可比性，見表1。

表1 各組一般資料情況

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋后制成蠟塊備用。實(shí)驗(yàn)均采用免疫組織化學(xué)鏈酶親和素-生物素法(SP法) 檢測TGF-β1在皮膚組織的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟：①常規(guī)脫蠟、水化；② 3%H202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；室溫孵育10 min，PBS洗 5 min×2次；③高溫隔熱水浴抗原修復(fù)；④封閉細(xì)胞Fc受體：封閉用羊血清(北京中杉金橋)封閉切片，置室溫下孵育15 min，傾去多余血清(不洗)；⑤滴加一抗(1∶150小鼠抗人IgG型TGF-β1單克隆抗體—圣克魯斯生物公司)，4 ℃過夜孵育；⑥室溫下復(fù)溫20 min，PBS液洗5 min×3次；⑦ 滴加二抗：滴加生物素標(biāo)記的IgG型山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋)，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×2次；⑧ 滴加三抗：滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(北京中杉金橋)，37 ℃孵育30 min，PBS液洗5 min×2次；⑨DAB顯色：滴加DAB液(武漢博士德)鏡下觀察適時(shí)終止(顯色時(shí)間約3 min左右)；⑩常規(guī)蘇木素復(fù)染、2%鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水、透明、中性樹膠封片。陰性對照為正常皮膚組織，空白對照用PBS代替一抗。免疫組化陽性細(xì)胞定量方法：所有組織切片均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師在普通光鏡下雙盲法讀片，觀察判斷細(xì)胞因子TGF-β1在銀屑病皮損和正常皮膚切片組織上的表達(dá)定位。采用OLYMPUS BX51顯微鏡，DP Manager圖像采集軟件和Image-proplus 6圖象分析軟件進(jìn)行定量分析，隨機(jī)選取每張切片5個(gè)視野(10×40倍)測定陽性細(xì)胞的累及光密度 (IOD值)及面積(area)，以IOD/area值表示TGF-β1相對含量，其值越大表示抗原含量越高。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。資料服從正態(tài)分布時(shí)，采用t檢驗(yàn)或方差分析；資料不服從正態(tài)分布時(shí)采用t’檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1在皮膚組織中的定位表達(dá) 在正常皮膚組織中，TGF-β1主要在表皮基底細(xì)胞中表達(dá)，在表皮棘層細(xì)胞及真皮中通常無表達(dá)或低表達(dá)；在銀屑病組皮損組織中，可見表皮層明顯增厚，真皮毛細(xì)血管增生，在增厚的表皮細(xì)胞中TGF-β1通常仍是無表達(dá)或低表達(dá)，其中在基底層細(xì)胞中的表達(dá)與正常皮膚組織相比明顯下調(diào)，但在真皮乳頭層有明顯表達(dá)；在空白對照組中TGF-β1在表皮、真皮區(qū)均無表達(dá)，見圖1。

圖1 TGF-β1(1：150)在皮膚組織中的表達(dá)(SP，×400) a：尋常型銀屑病組；b：紅皮型銀屑病組；c：膿胞型銀屑病組；d：正常皮膚組；e：空白對照組

2.2 TGF-β1在皮膚組織中的定量表達(dá) 銀屑病組TGF-β1表達(dá)量高于正常皮膚組，紅皮型銀屑病組、尋常型銀屑病組及總銀屑病組的平均光密度均值高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，膿胞型銀屑病組與正常對照組之間、三亞組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見表2。

表2 TGF-β1在各組皮膚組織中的表達(dá)

a：紅皮型亞組與尋常型亞組比較；b：紅皮型亞組與膿胞型亞組比較；c：尋常型亞組與膿胞型亞組比較

3 討論

TGF-β家族是一類廣泛存在于多個(gè)組織，具有多種調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋零、炎癥反應(yīng)、血管增生等多種細(xì)胞活動(dòng)。TGF-β分為三個(gè)亞型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，它們功能相似，其中TGF-β1為主要存在形式[2]，活性也最強(qiáng)。TGF-β1/Smads信號通路為其主要信號傳導(dǎo)方式，TGF-β1首先與TGF-βR結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)Smad2-3磷酸化，被活化的Smad2-3與Smad4形成復(fù)合體，然后進(jìn)入到細(xì)胞核，參與調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄。TGF-β1/Smads信號通路中，Smad2-3作為TGF-β1的下游細(xì)胞因子，Smad4則是Smad2-3進(jìn)入細(xì)胞核的橋梁，而Smad6-7則發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)功能[3]，這被稱為典型通路。近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道，除經(jīng)典通路外還存在MAP激酶途徑等多種非典型信號通路[4]。TGF-β1在體內(nèi)分布廣泛，能通過自分泌、旁分泌及內(nèi)分泌形式到達(dá)靶組織[5，6]，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

關(guān)于銀屑病的發(fā)病機(jī)制，目前認(rèn)為IL-23/Th17通路在其中起著至關(guān)重要的作用，IL-23能調(diào)節(jié)表皮增生、棘層增厚、過度不全角化及正型角化過度；Th17細(xì)胞自原始T細(xì)胞分化而來，能依次產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-22及IL-26，刺激角質(zhì)細(xì)胞使其異常增生，并進(jìn)一步產(chǎn)生前炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、抗菌肽，刺激炎癥區(qū)的其它免疫細(xì)胞，促使炎癥進(jìn)一步發(fā)展，除參與炎癥反應(yīng)，Th17細(xì)胞也在血管生成過程中扮演重要角色；IL-23是Th17細(xì)胞的上游刺激物，有促進(jìn)Th17細(xì)胞的發(fā)育及維持其功能的作用。TGF-β1是IL23/Th17軸中重要的介質(zhì)，其作用是促進(jìn)IL-23受體表達(dá)，以及促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[7，8]。同時(shí)作為炎癥介質(zhì)參與炎癥細(xì)胞浸潤，TGF-β1作為一種重要的炎癥介質(zhì)，根據(jù)所處環(huán)境不同，有促進(jìn)炎癥和抑制炎癥雙重的作用[9]。銀屑病主要病理表現(xiàn)為表皮增生、血管擴(kuò)張及增殖及炎癥細(xì)胞浸潤，TGF-β1在上述病理變化中都能起到調(diào)節(jié)作用[10，11]。

本實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1在銀屑病表皮基底層細(xì)胞中表達(dá)明顯下降。表皮基底層細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，增殖的細(xì)胞可進(jìn)一步發(fā)生分化，然后補(bǔ)充凋亡的表皮細(xì)胞并調(diào)控表皮層厚度。這提示TGF-β1具有抑制基底細(xì)胞增殖的作用，此結(jié)論與細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相符，體外細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)TGF-β1抑制表皮細(xì)胞增殖[12]。但在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到一種TGF-β1在表皮基底細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)的小鼠模型，即角蛋白5-轉(zhuǎn)化生長因子-β1(K5-TGF-β1)轉(zhuǎn)基因小鼠，其皮損中同時(shí)觀察到TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)及表皮增生，并伴有其它一些類似銀屑病的病理表現(xiàn)[12]，此現(xiàn)象與TGF-β1抑制細(xì)胞增殖的功能相矛盾。這可能是皮損處炎癥反應(yīng)中的其它因子(如TNF-α、IL-17、IL-22等)發(fā)揮了促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖的作用，并且其強(qiáng)度超過了TGF-β1對表皮增殖的抑制作用，導(dǎo)致雖然表皮中TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)，但病理上仍表現(xiàn)為表皮增生。用腫瘤壞死因子拮抗劑治療K5-TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠，當(dāng)炎癥控制后，表皮增殖減輕[2]，一定程度上支持了上述推測。另外，本實(shí)驗(yàn)還觀察到，通常情況下，TGF-β1由表皮基底層細(xì)胞分泌，真皮乳頭層不分泌或極少分泌，故考慮：銀屑病皮損處真皮乳頭層中TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)可能是由于在某些因素刺激下表皮基底層細(xì)胞中的TGF-β1大量通過旁分泌形式進(jìn)入導(dǎo)致。由于基底細(xì)胞中TGF-β1大量外流，引起TGF-β1代償性分泌增強(qiáng)，故皮損中總TGF-β1表達(dá)量是上調(diào)。而進(jìn)入真皮乳頭層的TGF-β1則成為一種炎癥介質(zhì)，參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)皮損區(qū)炎癥細(xì)胞的浸潤。若此假設(shè)得到進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的證實(shí)，則能為藥物開發(fā)提供另一種思路，即開發(fā)一種能抑制TGF-β1從基底層細(xì)胞進(jìn)入周圍組織并有一定的抗炎作用的藥物，或許能在銀屑病的治療上取得比TGF-β1拮抗劑更好的療效。故進(jìn)一步深入研究TGF-β1在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用對治療銀屑病有重要指導(dǎo)意義。銀屑病依臨床表現(xiàn)可分為尋常型、紅皮型、膿胞型和關(guān)節(jié)型，關(guān)節(jié)型伴有關(guān)節(jié)病變，皮膚表現(xiàn)與其它類型銀屑病相同。尋常型銀屑病的病理表現(xiàn)為角化過度伴角化不全，角化不全區(qū)可見munro微膿腫，顆粒層明顯減少或消失，棘層增厚、表皮突整齊向下延伸，乳頭層上方棘層變薄，毛細(xì)血管擴(kuò)張并迂曲，周圍可見淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，紅皮型和膿胞型的病理表現(xiàn)與尋常型基本相同，其中紅皮型真皮淺層血管充血擴(kuò)張更明顯，膿胞型可見kogoj微膿腫。此實(shí)驗(yàn)中銀屑病各亞型間TGF-β1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示TGF-β1表達(dá)量銀屑病類型無關(guān)，不能證明TGF-β1能調(diào)控銀屑病真皮淺層毛線血管擴(kuò)張程度與kogoj微膿腫形成。膿胞型銀屑病組TGF-β1表達(dá)較正常組增強(qiáng)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與標(biāo)本量較小有關(guān)。以后可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并在此基礎(chǔ)上依據(jù)銀屑病皮損的嚴(yán)重程度再進(jìn)行分組，了解與銀屑病嚴(yán)重程度之間的關(guān)聯(lián)性。另外，銀屑病的發(fā)病是多種細(xì)胞因子共同參與調(diào)控的結(jié)果，所以單個(gè)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(如K5-TGF-β1、K5-STAT3、K14-AREG等)都有類似銀屑病的皮膚表現(xiàn)，但都不能達(dá)到很令人滿意的程度[14]，進(jìn)一步弄清TGF-β1與其它細(xì)胞因子協(xié)同作用機(jī)制，才能對銀屑病有更全面的認(rèn)識(shí)，對提高銀屑病的診治水平有一定的幫助。

[1] Coimbra S，F(xiàn)igueiredo A，Castro E，et al.The roles of cells and cytokines in the pathogenesis of psoriasis[J].Int J Dermatol，2012，51(4)：389-395；quiz 395-398.

[2] Han G，Williams CA，Salter K，et al.A role for TGFbeta signaling in the pathogenesis of psoriasis[J].J Invest Dermatol，2010，130(2)：371-377.

[3] Massague J.TGF-beta signalling in context.[J].Nat Rev Cell Biol，2012，13(10)：616-630.

[4] Zhang YE.Non-Smad pathways in TGF-beta signaling[J].Cell Res，2009，19(1)：128-39.

[5] Ingman WV，Robertson SA.Mammary gland development in transforming growth factor beta1 null mutant mice：systemic and epithelial effects[J].Biology of reproduction，2008，79(4)：711-717.

[6] Devescovi V，Leonardi E，Ciapetti G，et al.Growth factors in bone repair[J].Chir Organi Mov，2008，92(3)：161-168.

[7] Han G，Li F，Singh TP，et al.The pro-inflammatory role of TGFbeta1：a paradox [J].Int J Biol Sci，2012，8(2)：228-235.

[8] Di Cesare A，P Di Meglio FO Nestle.The IL-23/Th17 axis in the immunopathogenesis of psoriasis[J].J Invest Dermatol，2009，129(6)：1339-1350.

[9] Kitoh A，T Nomura，K Kabashima.TGFbeta1，an epidermal controller of skin dendritic cell homeostasis[J].J Invest Dermatol，2013，133(1)：9-11.

[10]Honma M，Minami-Hori M，Takahashi H，et al.Podoplanin expression in wound and hyperproliferative psoriatic epidermis：regulation by TGF-beta and STAT-3 activating cytokines，IFN-gamma，IL-6，and IL-22[J].J Dermatol Sci，2012，65(2)：134-140.

[11] Singh TP，Schon MP，Wallbrecht K，et al.Involvement of IL-9 in Th17-associated inflammation and angiogenesis of psoriasis[J].PLoS One，2013，8(1)：e51752.

[12] Li AG，Wang D，F(xiàn)eng XH，et al.Latent TGFbeta1 overexpression in keratinocytes results in a severe psoriasis-like skin disorder[J].EMBO J，2004，23(8)：1770-1781.

[13] 李紅，胡晉紅.銀屑病相關(guān)基因動(dòng)物模型機(jī)制研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，61(6)：809-813.

Expression of TGF-β1in psoriatic skin tissue

BAIYang1，2，LIJiang-tao1，WANGLin3
(1.DepartmentofRheumatologyandImmunology，TheFirstPeople’sHospitalofYibin，Yibin644000，China；2.NorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000，China；3.DepartmentofDermatology，WestChinaHospital，Chengdu610000，China)

LIJiang-tao

Objective To investigate the role of TGF-β1in pathogenesis of psoriasis in order to provide a theoretical basis for the treatment of the disease.Methods By immunohistochemistry (IHC) SP assay，TGF-β1expression was determined in skin tissues obtained from patients with psoriasis vulgaris (n= 19)，pustular psoriasis (n= 20) and erythrodermic psoriasis(n= 19)，as well as normal skin tissues (n= 10)，and compared among the groups.Results In normal skin tissue，the expression of TGF-β1was located in the basal layer of epidermis，and the expression was weak or absent in the stratum spinosum of epidermis and the papillary layer of dermis.In psoriatic lesions，the expression of TGF-β1was located in the papillary layer of dermis but the expression was weak or absent expression in the epidermis.Quantitative analysis revealed that IOD/area was significantly higher in the psoriasis groups than that in normal group (P< 0.05).However，no significant difference among the three sub-types of psoriasis was detected (P> 0.05).Conclusion The abnormal expression of TGF-β1may play an important role in pathogenesis of psoriasis.

TGF-β1；Psoriasis；Immunohistochemistry；Cytokine

四川省衛(wèi)計(jì)委科研基金資助項(xiàng)目(編號：110599)；宜賓市科技局科研基金資助項(xiàng)目(編號：2012SF004)

李江濤

R758.63

A

1672-6170(2015)06-0040-04

2015-04-09；

2015-08-28)