黃艷君，羅 勇，張中念，曹飛虎，董 明，宋曉靈，張弟文

(1.四川省綿陽市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 綿陽 621000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016；3.重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

電刺激小腦頂核對(duì)大鼠局灶腦缺血/再灌注后腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子mRNA的影響

黃艷君1，羅 勇2，張中念1，曹飛虎1，董 明1，宋曉靈1，張弟文1

(1.四川省綿陽市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 綿陽 621000；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016；3.重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

目的 探討電刺激小腦頂核(fastigial nucleus stimulation，F(xiàn)NS)對(duì)受損腦組織功能重建的作用。方法 將180只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組(NC組)、假手術(shù)組(SC組)、模型組(I/R組)和小腦頂核假刺激組(I/RFs組)、小腦頂核刺激組(I/RF組)各36只。采用線栓法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血/再灌注模型。應(yīng)用原位雜交法檢測隨缺血再灌注后1、3、7、14、21、28天各組側(cè)腦室和海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，(BDNF)mRNA表達(dá)。結(jié)果 光鏡下正常腦組織側(cè)腦室和海馬區(qū)域BDNF mRNA陽性反應(yīng)較弱，局灶腦缺血/再灌注后I/R組缺血側(cè)紋狀體內(nèi)BDNF mRNA表達(dá)增加(P< 0.05)，7天達(dá)一小高峰(P< 0.01)，14天后迅速下降(P< 0.01)；而缺血/再灌注后再予FNS，I/RF組BDNF mRNA陽性表達(dá)明顯增加(P< 0.01)，7天達(dá)到高峰(P< 0.01)，在海馬且BDNF mRNA陽性反應(yīng)染色更深，部分神經(jīng)元可見長的突起，狀如蝌蚪，維持到14天，然后逐漸緩慢下降，21天時(shí)仍明顯高于其余各組(P< 0.01)，28天時(shí)仍明顯高于正常水平(P< 0.01)。結(jié)論 FNS能持續(xù)上調(diào)BDNF mRNA的表達(dá)，使其表達(dá)更高，高峰延遲。FNS對(duì)腦缺血具有較持久的腦保護(hù)作用。

電刺激小腦頂核；局灶腦缺血/再灌注；神經(jīng)營養(yǎng)因子；大鼠

小腦頂核(fastigial nucleus，F(xiàn)N)是位于第四腦室頂小腦白質(zhì)內(nèi)的四對(duì)核團(tuán)之一，有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)N由腎上腺素能的固有神經(jīng)元及過路神經(jīng)纖維所構(gòu)成，電刺激小腦頂核(fastigial nucleus stimulation，F(xiàn)NS)能激發(fā)其固有神經(jīng)元，導(dǎo)致血壓升高、血管反射性擴(kuò)張及腦血流增加，并由此引出了“條件性中樞神經(jīng)源性神經(jīng)保護(hù)(conditioned central neurogenic neuroprotection，CCNN)”的概念[1]。神經(jīng)營養(yǎng)因子與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)密切相關(guān)，對(duì)神經(jīng)再生、神經(jīng)元遷移、軸突的發(fā)芽、延長和成束以及神經(jīng)環(huán)路的正確形成起著重要作用。本研究觀察了局灶腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)mRNA的動(dòng)態(tài)變化以及FNS后的動(dòng)態(tài)變化，探討FNS對(duì)受損腦組織功能重建的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康雄性的Wistar大鼠180只，清潔級(jí)，8周齡，體質(zhì)量250～300 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分為正常組(NC組)、假手術(shù)組(SC組)、模型組(I/R組)、小腦頂核假刺激組(I/RFs組)和小腦頂核刺激組(I/RF組)各36只，每組根據(jù)再灌注時(shí)間的不同又分為1、3、7、14、21和28d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察(n=6)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 針對(duì)大鼠BDNF靶基因的mRNA序列的寡核甘酸探針序列：5′-CTTAC TATGG TTATT TCATA CTTTG GTTGC-3′；5v-GCTGA GCGTG TGTGA CAGTA TTAGT GAGTG-3′；5′-ACACT TCTTG TGTAT GTACA TTGAC CATTA-3′(探針由武漢博士德生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成并用地高辛標(biāo)記)。原位雜交試劑盒和原位雜交專用蓋玻片(武漢博士德)，DAB顯色劑(北京中山)；DEPC和Poly-L-Lysine[Sigma(USA)]，立體定位儀，SEN 3301型方波脈沖電子刺激器(日本光電公司)；電動(dòng)恒流泵(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2.2 局灶腦缺血/再灌注模型制備 根據(jù)Longa等[2]報(bào)道的方法，參照羅勇等[3]的經(jīng)驗(yàn)，采用線栓法制備右側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶腦缺血再灌注模型。栓塞成功的大鼠缺血1 h，再次麻醉，拔出線栓至頸外動(dòng)脈殘端內(nèi)，實(shí)現(xiàn)再灌注。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：左側(cè)肢體疼痛回縮遲鈍或消失，提尾倒懸時(shí)左上肢向胸前屈曲，行走時(shí)向左側(cè)傾倒或向左轉(zhuǎn)圈；右側(cè)出現(xiàn)霍納(Honer’s)氏征。排除標(biāo)準(zhǔn)：神經(jīng)功能評(píng)分低于2分者，蛛網(wǎng)膜下腔出血者，HE染色無缺血病理改變者，未到觀察時(shí)相點(diǎn)便死亡者。凡因上述因素導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)不足預(yù)定數(shù)量者采用隨機(jī)抽樣原則補(bǔ)齊。

1.2.3 干預(yù)方法 大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，均于缺血后1 h行再灌注，并于再灌注后立即刺激左側(cè)小腦頂核1 h。I/RF組大鼠給予電刺激小腦頂核：大鼠用3.5%水合氯醛腹腔注射(1 ml/100 g)麻醉，固定于立體定向儀上，根據(jù)Wistar大鼠腦立體定向圖譜[4，5]，結(jié)合鼠的大小確定左側(cè)小腦頂核定位，以前囟后緣為零點(diǎn)，正中線向后11.4～11.8 mm，旁開0.8～1.0 mm，深5.2～5.7 mm。于左側(cè)顱骨上鉆1個(gè)孔，將方波脈沖電子刺激器的同心圓電極插入左側(cè)小腦頂核(病灶對(duì)側(cè))進(jìn)行刺激。刺激參數(shù)：電流強(qiáng)度為50 μA、頻率為50～100 Hz、時(shí)程為0.5 ms的直角方波脈沖。刺激時(shí)間：于再灌注后立即給予電刺激，持續(xù)時(shí)間1 h。I/RFs組操作同I/RF組，電極插入小腦頂核但不通電流刺激，只留針1 h。I/R組制備腦缺血再灌注模型，不給予電刺激。SC組分離頸外動(dòng)脈并結(jié)扎遠(yuǎn)端，線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈但不栓塞大腦中動(dòng)脈，不給予電刺激。NC組不造模也不給予電刺激。于腦缺血再灌注后1、3、7、14、21和28 d，經(jīng)左心室常規(guī)灌注固定，開顱取腦，由前向后作冠狀切片，取經(jīng)側(cè)腦室腦組織塊各1塊，行固定、脫水、浸蠟、包埋、石蠟切片(片厚4 μm)。取材部位：側(cè)腦室(A-P坐標(biāo)，bregma-0.30至bregma-1.2 mm)，海馬(A-P坐標(biāo)，bregma-4.5至bregma-3.14 mm)。

1.3 圖像分析 切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)(×200)下，隨機(jī)選擇10個(gè)非重疊視野，以缺血側(cè)側(cè)腦室為觀察部位，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只動(dòng)物，每只動(dòng)物的每個(gè)部位隨機(jī)取5張非連續(xù)切片，應(yīng)用重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室北航CM-2000B型生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算平均陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 參照Zea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[3]：0分，無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分，輕度局灶性神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展左側(cè)前肢)；2分，中度局灶性神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)轉(zhuǎn)圈)；3分，中度局灶性神經(jīng)功能缺失(向左側(cè)傾倒)；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。所有動(dòng)物于腦缺血再灌注后1、6、12 h及1、3、7 d進(jìn)行評(píng)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS 8.2統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析及q檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P< 0.01為差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)癥狀學(xué)評(píng)分 大鼠腦缺血/再灌注1 h后均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，各組間神經(jīng)功能評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.6699)；其他時(shí)間點(diǎn)I/R組和I/RFS組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，I/RF組低于I/R組和I/RFS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，P< 0.01)，見表1。

表1 大鼠局灶腦缺血/再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分比較 (分)

與I/R組和I/RFs組比較：#P< 0.05，*P< 0.01

2.2 側(cè)腦室紋狀體區(qū)BDNF mRNA的表達(dá)水平

NC組紋狀體區(qū)域BDNF mRNA陽性反應(yīng)較弱，與SC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。I/R組局灶腦缺血/再灌注后1 d，缺血側(cè)紋狀體內(nèi)BDNF mRNA表達(dá)增加，3 d明顯增加，7 d達(dá)高峰，14 d下降，21 d明顯下降，28 d時(shí)下降到略高于正常水平(P< 0.05，P< 0.01)。I/RFS組與I/R組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。缺血/再灌注后再予FNS，I/RF組BDNF mRNA陽性表達(dá)明顯增加(P< 0.01)，3 d時(shí)增加更明顯，7 d達(dá)到高峰，維持到14 d，然后逐漸緩慢下降，21 d時(shí)仍明顯高于其余各組(P< 0.01)，28 d時(shí)明顯下降，略高于I/R組和I/RFS組(P< 0.05)，明顯高于正常水平(P< 0.01)，見表2。

2.3 海馬區(qū)BDNF mRNA的表達(dá)水平 局灶腦缺血/再灌注后，I/R組缺血側(cè)海馬BDNF mRNA表達(dá)增加，1 d時(shí)即有增多，3 d達(dá)到高峰，7 d迅速下降(P< 0.01)；I/RFS組與I/R組變化相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。缺血/再灌注后再予FNS，I/RF組BDNF mRNA陽性表達(dá)明顯增加，7 d時(shí)達(dá)到高峰，14 d逐漸下降(P< 0.01)，21 d進(jìn)一步下降(P< 0.05)，28 d仍明顯高于正常水平(P< 0.01)，見表3。

3 討論

神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)系統(tǒng)重要的生物活性因子，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常分化、發(fā)育、成熟、維持功能和存活、損傷修復(fù)等均具有重要的生物學(xué)作用。BDNF參與缺血性腦損傷的保護(hù)過程，BDNF能減少缺血引起的梗死面積，保護(hù)半影區(qū)神經(jīng)元，并能抑制遲發(fā)性神經(jīng)元壞死[4]。

表2 各實(shí)驗(yàn)組紋狀體區(qū)BDNF mRNA的表達(dá)水平(光密度)

與NC組和SC組比較：#P< 0.05，*P< 0.01；與I/R組和I/RFs組比較：*P< 0.05，▲P< 0.01

表3 各實(shí)驗(yàn)組海馬區(qū)BDNF mRNA的表達(dá)水平(光密度)

與NC組和SC組比較：#P< 0.05，*P< 0.01；與I/R組和I/RFs組比較：*P< 0.05，▲P< 0.01

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)NS是高等動(dòng)物機(jī)體內(nèi)存在一種固有的自身保護(hù)機(jī)制，受內(nèi)外環(huán)境刺激后被激活，可產(chǎn)生較廣泛、持久的神經(jīng)保護(hù)作用[5，6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)NS后大腦皮質(zhì)局部腦血流(rCBF)的增加可達(dá)對(duì)照組的300%，而不伴腦組織糖代謝率的改變[7]；FNS 1 h，可使腦梗死體積縮小約50%，產(chǎn)生的腦保護(hù)作用可持續(xù)10 d以上；其縮小腦梗死體積的效果是特異性的，刺激其他腦區(qū)則不能減輕腦缺血損害[8～16]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，在正常腦組織中，BDNF mRNA表達(dá)廣泛，但陽性反應(yīng)很弱。局灶腦缺血/再灌注后3 d，BDNF mRNA在缺血側(cè)海馬和大腦皮質(zhì)可達(dá)一小高峰，而FNS后BDNF mRNA陽性反應(yīng)更加強(qiáng)烈，7 d時(shí)才達(dá)高峰，一直維持到14 d，然后緩慢下降。研究發(fā)現(xiàn)[17]，BDNF mRNA及其受體TrkB在靶神經(jīng)元變性區(qū)域特異性上調(diào)，其上調(diào)發(fā)生在前3 w，即細(xì)胞遷移、分化及整合階段，且在錐體神經(jīng)元進(jìn)行性凋亡的時(shí)期上調(diào)尤為明顯，表明BDNF可能參與并影響了腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和移行。這與我們的研究結(jié)果一致。更重要的是，BDNF mRNA在正常腦組織紋狀體中表達(dá)很少，但卻在FNS后大量表達(dá)，表達(dá)時(shí)程也較長，一直持續(xù)到缺血后28 d仍高于正常組。因臨床上對(duì)缺血性腦血管病患者的治療是長期的，BDNF又是一種不能通過血腦屏障的蛋白質(zhì)，所以，通過“非藥物”手段增加內(nèi)源性BDNF的合成和釋放，可避免給予外源性BDNF所帶來的各種困難，說明FNS更具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值和臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)證明，局灶缺血/再灌注后神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移，同時(shí)BDNF mRNA也在一定時(shí)間內(nèi)表達(dá)上調(diào)，再給予FNS后的這種變化更加明顯，提示FNS促進(jìn)了腦內(nèi)細(xì)胞分泌一定數(shù)量內(nèi)源性BDNF，抑制神經(jīng)元的凋亡，改善了腦內(nèi)神經(jīng)元生存環(huán)境而促進(jìn)神經(jīng)元再生修復(fù)。既往研究證實(shí)，F(xiàn)NS可抑制谷氨酸的釋放，抑制海馬CA1區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元壞死及半暗帶區(qū)神經(jīng)元喪失[18，19]，增加血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，促進(jìn)腦缺血后毛細(xì)血管新生[20，21]，抑制梗死皮質(zhì)和海馬NgR mRNA及其相關(guān)蛋白，促進(jìn)軸突生長[21]。本實(shí)驗(yàn)初步顯示，F(xiàn)NS后可明顯改善局灶腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損程度，可能與其保持了側(cè)腦室區(qū)域較高水平的BDNF mRNA表達(dá)有密切關(guān)系。研究表明，腦缺血后神經(jīng)營養(yǎng)因子可在一定時(shí)間內(nèi)表達(dá)上調(diào)，而神經(jīng)營養(yǎng)因子又是神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、分化、網(wǎng)絡(luò)化的重要因素。FNS可能通過以上途徑抑制了腦缺血過程中神經(jīng)細(xì)胞凋亡，有利于細(xì)胞存活，改善了神經(jīng)功能，但其確切的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Reis DJ，Golanov EV，Galea E，et al.Central neurogenic neuroprotection：central neural systems that protect the brain from hypoxia and ischemia[J].Ann NY Acad Sci，1997，835(1)：168-186.

[2] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke，1989，20(1)：84-91.

[3] LUO Yong，Dong Weiwei.An experimental study on focal cerebral ischemia/reperfusion model in Wistar rats with suture method[J].Journal of Chongqing Medical University，2002，27(1)：1-4.

[4] 陳林，羅永杰，熊毅.腦梗死急性期SD大鼠血清血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子變化特點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2011，8(6)：79-82.

[5] 付蓓蓓，魏玉璽，汪健.鹽酸帕羅西汀修復(fù)腦缺血后神經(jīng)組織的實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2014，11(6)：24-27.

[6] Paxinos G，Watso Endres M，F(xiàn)an G，et al.Ischemic brain damage in mice after selectively odifying BDNF or NT4 gene expression[J].J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(1)：139-144.

[7] Doba N，Reis DJ.Changes in regional blood flow and cardiodynamics evoked by electrical stimulation of the fastigial nucleus in the cat and their similarity to orthostatic reflexes[J].J Physiol，1972，227(3)：729-747.

[8] Golanov EV，Zhou P.Neurogenic neuroprotection[J].Cell Mol Neurobiol，2003，23(4-5)：651-663.

[9] Reis DJ，Berger SB，Underwood MD，et al.Electrical stimulation of cerebellar fastigial nucleus reduces ischemic infarction elicited by middle cerebral artery occlusion in rat[J].J Cereb Blood Flow Metab，1991，11(5)：810-818.

[10]Berger SB，Ballon D，Graham M，et al.Magnetic resonance imaging demonstrates that electric stimulation of cerebellar fastigial nucleus reduces cerebral infarction in rats[J].Stroke，1990，21(11 Suppl)：III172-6.

[11]Zhang F，Iadecola C.Stimulation of the fastigial nucleus enhances EEG recovery and reduces tissue damage after focal cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab，1992，12(6)：962-970.

[12]Yamamoto S，Golanov EV，Reis DJ.Reductions in focal ischemic infarctions elicited from cerebellar fastigial nucleus do not result from elevations in cerebral blood flow[J].J Cereb Blood Flow Metab，1993，13(6)：1020-1024.

[13]Golanov EV，Yamamoto S，Reis DJ.Electrical stimulation of cerebellar fastigial nucleus fails to rematch blood flow and metabolism in focal ischemic infarctions[J].Neurosci Lett，1996，210(3)：181-184.

[14]Reis DG，Golanov EV，Galea E，et al.Central neurogenic neuroprotection：central neural systems that protect the brain from hypoxia and ischemia[J].Ann NY Acad Sci，1997，835(1)：168-186.

[15]Glickstein SB，Golanov EV，Reis DJ.Intrinsic neurons of fastigial nucleus mediate neurogenic neuroprotection against excitotoxic and ischemic neuronal injury in rat[J].J Neurosci，1999，19(10)：4142-4154.

[16]Golanov EV，Christensen JR，Reis DJ.The medullary cerebrovascular vasodilator area mediates cerebrovascular vasodilation and electro-encephalogram synchronization elicited from cerebellar fastigial nucleus in Sprague-Dawley rats[J].Neurosci Lett，2000，288(3)：183-186.

[17]Glickstein SB，Ilch CP，Reis DJ，et al.Stimulation of the subthalamic vasodilator area and fastigial nucleus independently protects the brain against focal ischemia[J].Brain Res，2001，912(1)：47-59.

[18]Reis DJ，Kobylarz K，Yamamoto S，et al.Brief electrical stimulation of cerebellar fastigial nucleus conditions long-lasting salvage from focal cerebral ischemia：conditioned central neurogenic neuroprotection[J].Brain Res，1998，780(1)：161-165.

[19]Wang Y，Sheen VL，Macklis JD.Cortical interneurons upregulate neurotro-phins in vivo in response to targeted apoptotic degeneration of neighboring pyramidal neurons[J].Exp Neurol，1998，154(2)：389-402.

[20]Zhou P，Qian L，Zhou T，Iadecola C.Mitochondria are involved in the neurogenic neuroprotection conferred by stimulation of cerebellar fastigial nucleus[J].J Neurochem，2005，95(1)：221-229.

[21]Xia Yilu，Luo Yong，Dong Weiwei，et al.Effect and mechanism of fastigial nucleus stimulation on stroke in rats[J].Journal of Apoplexy and Nervous Diseases，1999，16(1)：3-5.

[22]Shi Zhenghong，Dong Weiwei.Role of fastigial nuclei stimulation on angiogenesis in rats with local cerebral ischemia[J].Journal of Apoplexy and Nervous Diseases，2003，20(3)：250-252.

[23]Zhang S，Zhang Q，Zhang JH，et al.Electro-stimulation of cerebellar fastigial nucleus (FNS) improves axonal regeneration.Front Biosci，2008，13(1)：6999-7007.

Effect of electrical stimulating to fastigial nucleus on brain derived neurotrophic factor in brain of adult rat after focal cerebral ischemia/reperfusion

HUANG Yan-jun，LUO Yong，ZHANG Zhong-nian，CAO Fei-hu，DONG Ming，SONG Xiao-ling，ZHANG Di-wen

四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：080211)；重慶市科委攻關(guān)項(xiàng)目(編號(hào)：2003-7)；重慶市衛(wèi)生局科研基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2005-2-179)

R743.31

B

1672-6170(2015)06-0024-04

2015-03-09；

2015-07-05)