尹立國(guó) 崔建忠 高俊玲 趙雅寧

腦創(chuàng)傷后Edaravone腦保護(hù)作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

尹立國(guó) 崔建忠 高俊玲 趙雅寧

目的:探討Edaravone對(duì)腦創(chuàng)傷后保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法采用改進(jìn)的Marmarou’s法建立大鼠中度閉合性彌漫性顱腦損傷模型，應(yīng)用TAB法、免疫組化，TUNEL法對(duì)大鼠傷后皮質(zhì)自由基、細(xì)胞色素C及凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。結(jié)果傷后給予Edaravone能明顯減少自由基水平，降低細(xì)胞色素c表達(dá)和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)。結(jié)論Edaravone對(duì)顱腦創(chuàng)傷有治療作用，其機(jī)制之一是通過(guò)減少自由基生成，抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開(kāi)放，減少細(xì)胞色素c釋放，進(jìn)而減少神經(jīng)細(xì)凋亡。

腦創(chuàng)傷;Edaravone;自由基;線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔;細(xì)胞色素c;凋亡

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)有較高的發(fā)生率，是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者傷殘及死亡的主要原因，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。Edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)是一種強(qiáng)力的自由基清除劑，能阻礙脂氧合酶代謝［1］并且在臨床治療急性腦缺血，取得良好效果［2，3］。但對(duì)其腦保護(hù)作用具體機(jī)制的研究筆者尚不多見(jiàn)，本研究運(yùn)用改進(jìn)的Marmarou方法建立大鼠彌漫性腦損傷型，證明腦創(chuàng)傷后Edaravone對(duì)腦保護(hù)作用的可能機(jī)制，以期為臨床治療提供理論依據(jù)和開(kāi)拓新的治療前景。

1 材料與方法

1.1 腦創(chuàng)傷模型的制備與分組健康雄性SD大鼠90只(體重300～350 g，購(gòu)自北京維通力華公司，清潔級(jí)，自然光照，環(huán)境安靜，溫度適中，大鼠自由進(jìn)食水，飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn))隨機(jī)分為對(duì)照組、顱腦創(chuàng)傷組、治療組。每組設(shè)傷后1 h、3 h、6 h、24 h、48 h、72 h 6個(gè)時(shí)相點(diǎn)。對(duì)照組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)3只大鼠，創(chuàng)傷組和治療組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)6只大鼠。各組未達(dá)到規(guī)定時(shí)相點(diǎn)死亡的大鼠從實(shí)驗(yàn)中剔除。另取90只大鼠按相同的方法分組，用于丙二醛(MDA)測(cè)定。動(dòng)物置乙醚麻醉缸中，以乙醚吸入方式深度麻醉動(dòng)物，麻醉后的大鼠俯臥于落體致傷海綿墊上，70%乙醇消毒顱頂部皮膚，沿正中線矢狀切開(kāi)頭皮，剝離骨膜，顯露人字縫與冠狀縫，將一不銹鋼墊固定在大鼠冠狀縫與人字縫之間將大鼠頭部固定于打擊模型架下的頭部固定裝置中，使重450 g，直徑18 mm的銅柱沿垂直玻璃管于1.2 m高度自由落下，撞擊大鼠顱骨頂部的鋼墊，造成大鼠中度彌漫性顱腦損傷。撞擊后即刻移開(kāi)大鼠，以免銅柱反彈造成頭部二次打擊傷。給予顱腦損傷后大鼠，頭皮切口常規(guī)消毒、縫合。對(duì)照組僅給予相同的麻醉處理及沿中線矢狀切開(kāi)頭皮、剝離骨膜、在冠狀縫與人字縫之間粘鋼墊，置致傷海綿墊上，但不行自由落體致傷，而后常規(guī)消毒、縫合切口。3組未到規(guī)定時(shí)相死亡的大鼠予以剔除。

1.2 給藥方法治療組Edaravone 10 mg/kg，對(duì)照組、創(chuàng)傷組給予等量0.9%氯化鈉溶液。注射方法為傷后10 min，尾靜脈注射，每24小時(shí)注射1次。

1.3 標(biāo)本檢測(cè)

1.3.1 氧自由基中間產(chǎn)物MDA測(cè)定大鼠按傷后各時(shí)相點(diǎn)麻醉，迅速斷頭處死，取大腦皮質(zhì)受損及周?chē)鷧^(qū)0.5 cm，在0℃用剪刀將組織剪碎成泥，冰上勻漿后按南京建成MDA檢測(cè)說(shuō)明書(shū)提供方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 細(xì)胞色素c檢測(cè):標(biāo)本甲醛固定，石蠟切片，按武漢博士德提供細(xì)胞色素c檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL法)按Roche公司提供TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作。

1.3.4 陽(yáng)性細(xì)胞免疫反應(yīng)強(qiáng)弱:采用Motic Med 6.0計(jì)算機(jī)真彩色圖象分析系統(tǒng)以平均光密度進(jìn)行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，多組間同一時(shí)間點(diǎn)及同一組中不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧自由基檢測(cè)結(jié)果傷后6 h即可檢測(cè)到MDA升高，隨著時(shí)間推移逐漸增高，與對(duì)照組相比較，24 h已顯著升高(P＜0.01)，48 h達(dá)高峰。與創(chuàng)傷組比較，藥物處理組在各時(shí)相點(diǎn)均明顯降低，以24、48和72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 大鼠腦創(chuàng)傷后大腦皮質(zhì)自由基(MDA)水平動(dòng)態(tài)變化nmol/mgpro，±s

表1 大鼠腦創(chuàng)傷后大腦皮質(zhì)自由基(MDA)水平動(dòng)態(tài)變化nmol/mgpro，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與創(chuàng)傷組比較，#P＜0.01

組別傷后1 h傷后3 h傷后6 h傷后24 h傷后48 h傷后72 h對(duì)照組(n=18)4.55±0.12 4.50±0.12 4.56±0.11 4.52±0.17 4.50±0.11 4.38±0.19創(chuàng)傷組(n=36)4.56±0.11 4.57±0.15 4.74±0.14 5.74±0.15*7.66±0.16*6.37±0.11*治療組(n=36)4.54±0.11 4.57±0.12 4.71±0.10 5.32±0.09*#6.24±0.05*#5.43±0.15*#

2.2 創(chuàng)傷組Ctyc免疫反應(yīng)在傷后6 h即升高，傷后24 h達(dá)高峰，以后迅速下降，Edaravone治療組與創(chuàng)傷組比較明顯降低，在24 h、48 h、72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2、圖1～3。

表2 大腦創(chuàng)傷后大腦皮質(zhì)cyt-c表達(dá)動(dòng)態(tài)變化平均光密度值×10 000，±s

表2 大腦創(chuàng)傷后大腦皮質(zhì)cyt-c表達(dá)動(dòng)態(tài)變化平均光密度值×10 000，±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與創(chuàng)傷組比較，#P＜0.01

組別傷后1 h傷后3 h傷后6 h傷后24 h傷后48 h傷后72 h對(duì)照組(n=18)4.84±0.15 4.83±0.08 4.87±0.11 4.85±0.17 4.96±0.10 4.96±0.14創(chuàng)傷組(n=36)4.88±0.12 5.85±0.18*6.99±0.19*15.53±0.16*8.74±0.10*6.69±0.12*治療組(n=36)4.81±0.09 5.88±0.13*6.80±0.18*13.54±.10*#6.76±0.13*#5.82±0.10*#

2.3 傷后1 h即可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，以后凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，并于48 h達(dá)高峰，Edaravone明顯降低腦創(chuàng)傷后大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)，與創(chuàng)傷組比較在24 h、48 h、72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表3，圖4～6。

表3 大鼠腦創(chuàng)傷后大腦皮質(zhì)神經(jīng)凋亡數(shù)的動(dòng)態(tài)變化±s

表3 大鼠腦創(chuàng)傷后大腦皮質(zhì)神經(jīng)凋亡數(shù)的動(dòng)態(tài)變化±s

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01;與創(chuàng)傷組比較，#P＜0.01

組別傷后1 h傷后3 h傷后6 h傷后24 h傷后48 h傷后72 h對(duì)照組3.5±0.8 3.4±1.3 3.7±1.3 3.8±0.7 4.7±0.9 4.14±0.14創(chuàng)傷組40.4±4.6*54.2±3.2*64.2±2.5*90.8±1.9*106.0±5.2*93.56±3.06*治療組38.5±2.4*53.9±2.6*63.0±2.2*#82.5±2.1*#94.1±2.1*#80.87±2.15*#

圖1 對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)cyt-c表達(dá)(免疫組化×400)

圖2 創(chuàng)傷24 h大鼠大腦皮質(zhì)cyt-c表達(dá)(免疫組化× 400)

圖3 給藥24 h大鼠大腦皮質(zhì)cyt-c表達(dá)(免疫組化× 400)

圖5 創(chuàng)傷后48 h大鼠大腦皮質(zhì)(TUNEL染色×400)

圖4 對(duì)照組大鼠大腦皮質(zhì)(TUNEL染色×400)

圖6 給藥48 h大鼠大腦皮質(zhì)(TUNEL染色×400)

3 討論

生理狀態(tài)下，機(jī)體自由基的產(chǎn)生與清除間保持著動(dòng)態(tài)平衡。腦創(chuàng)傷后，線粒體在導(dǎo)致組織組織損傷的分子事件中起到關(guān)鍵性作用，由于顱內(nèi)壓增高，血管痙攣及呼吸紊亂等，產(chǎn)生能量代謝障礙，由線粒體呼吸鏈和胞漿酶系(如黃嘌呤氧化酶)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。Crompton［4］論述了ROS的形成增多導(dǎo)致PTP開(kāi)放。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開(kāi)放后可導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡［4－6］。Lewen等［7］也認(rèn)為T(mén)BI后氧自由基產(chǎn)生增加可以導(dǎo)致線粒體功能紊亂，增加的氧自由基與鈣離子相互作用導(dǎo)致線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，細(xì)胞色素c從損壞的線粒體釋放，通過(guò)caspase依賴(lài)方式，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

Edaravone(3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one)是2001年開(kāi)發(fā)上市的神經(jīng)元保護(hù)劑和具有捕獲羥自由基的活性抗氧化劑。顧學(xué)蘭等［8］研究結(jié)果表明Edaravone注射液能有效減輕腦出血后神經(jīng)功能缺損癥狀和出血后繼發(fā)性缺血性損傷。在大鼠局灶腦缺血模型中，Edaravone能明顯減輕腦缺血，減少腦梗死面積。作用機(jī)制可能是抑制主要包括自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物在內(nèi)的脂氧化酶［9］。該藥主要用于治療急性腦梗死，但關(guān)于腦創(chuàng)傷的研究鮮有報(bào)道，本研究應(yīng)用Marmarou腦創(chuàng)傷模型，研究Edaravone對(duì)腦創(chuàng)傷的保護(hù)作用。本試驗(yàn)中，Edaravone能顯著降低各時(shí)段代表自由基含量的MDA水平，還降低了由線粒體釋放的Cytc的表達(dá)并減少腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量，說(shuō)明腦創(chuàng)傷后Edaravone有明顯的腦保護(hù)作用，其機(jī)制之一是通過(guò)減少自由基生成，通過(guò)線粒體釋放Cytc的某個(gè)環(huán)節(jié)而發(fā)揮其腦保護(hù)作用。一項(xiàng)關(guān)于心肌缺血再灌注的實(shí)驗(yàn)證明Edaravone能作用于MPTP，有效地減少缺血再灌注損傷引起的心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡以及線粒體的腫脹程度［10］。既然自由基能作用于線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔，使其開(kāi)放引起細(xì)胞釋放細(xì)胞色素c，引起細(xì)胞凋亡，而Edaravone是一種強(qiáng)力的自由基清除劑，減少代表PTP功能狀態(tài)的Cytc的表達(dá)進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以肯定腦創(chuàng)傷后Edaravone對(duì)腦保護(hù)的作用機(jī)制之一是通過(guò)限制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放減少細(xì)胞色素c釋放而起作用的。

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Experimental study of the protective effect of Edaravone on brain after traumatic brain injury

YIN Liguo*，CUI Jianzhong，GAO Junling，et al.*Department of Neurosurgery，Zunhua City People’s Hospital，Hebei，Zunhua 064200，China

ObjectiveTo investigate the possible action mechanism of protective effect of Edaravone on brain after traumatic brain injury.M ethodsThe middle degree closed diffused craniocerebral injury models in rats were established by improved Marmarou＇s method.After the models were successfully established，the free radical in cortex of the rats，Cyt-c and apoptosis cell numbers were detected and observed dynamically by TAB，immunohistochemry，TUNEL，respectively.ResultsEdaravone could decrease obviously the levels of free radical，the expression of Cyt-c and apoptosis nerve cells after traumatic brain injury Conclusion Edaravone is effective in treating traumatic brain injury，and one of action mechanisms is to reduce generation of free radical，inhibit opening of mitochondrial permeability transition pore(MPTP)，reduce releasing of Cytc，and then decrease nerve cell apoptosis.

traumatic brain injury;Edaravone;free radical;mitochondrial permeability transition pore;Cytc;apoptosis

R 749.12

A

1002－7386(2015)03－0353－03

2014－09－21)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.008

064200河北省遵化市人民醫(yī)院(尹立國(guó));河北省唐山市工人醫(yī)院(崔建忠);河北聯(lián)合大學(xué)(高俊玲、趙雅寧)

崔建忠，063000河北省唐山市工人醫(yī)院; E-mail:JZHC01@hotmail.com