呂柏楠 石曉明 吳勝春 唐雷 楊永賓

水通道蛋白-5對結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制

呂柏楠 石曉明 吳勝春 唐雷 楊永賓

目的:檢測水通道蛋白-5(AQP-5)在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，分析TAZ與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及患者預(yù)后的關(guān)系;同時檢測腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移蛋白金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)、TIMP-2蛋白的表達(dá)，并對其意義進(jìn)行分析。方法收集98例區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的結(jié)直腸癌及40例癌旁正常組織石蠟組織標(biāo)本，免疫組化(SP)染色檢測AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達(dá)情況。記錄患者的臨床資料并進(jìn)行隨訪，分析AQP-5對結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的意義，并對AQP-5與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移蛋白的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果AQP-5、MMP-2、MMP-9在腫瘤組織中表達(dá)高于癌旁組織，TIMP-1、TIMP-2表達(dá)則低于癌旁組織(P＜0.05)。AQP-5、MMP-2蛋白表達(dá)水平均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目呈正相關(guān)(P＜0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，AQP-5陽性者生存期較短(P＜0.05)。在結(jié)直腸癌組織中AQP-5與MMP-2、MMP-9、TIMP-1之間均有相關(guān)性(P＜0.05)。結(jié)論AQP-5蛋白可促進(jìn)結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，AQP-5陽性是患者預(yù)后較差的標(biāo)志。AQP-5的這種作用可能是通過調(diào)節(jié)侵襲轉(zhuǎn)移蛋白實現(xiàn)的。

結(jié)直腸癌;水通道蛋白-5;轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié);預(yù)后;侵襲轉(zhuǎn)移蛋白

近年來我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率及死亡率不斷升高，嚴(yán)重危害人們健康。腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌進(jìn)展的主要原因之一，但迄今導(dǎo)致結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制還沒有完全闡明。確定轉(zhuǎn)移調(diào)控基因?qū)Y(jié)直腸癌的病情判斷及診治意義重大。水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是一類存在于細(xì)胞膜上的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，AQP-5即為其中成員之一。研究發(fā)現(xiàn)AQP-5與肺癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤有關(guān)［1－3］，在結(jié)直腸癌中也存在異常表達(dá)［4］，但臨床意義及作用機(jī)制報道不多。在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中，金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族發(fā)揮了重要作用［5，6］。本研究檢測了AQP-5及MMPs家族中主要成員MMP-2、MMP-9及其抑制物金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)、TIMP-2的表達(dá)，分析了AQP-5在結(jié)直腸癌的臨床及預(yù)后意義，并分析了AQP-5與MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在腫瘤中的關(guān)系，探討了AQP-5在結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料2011年4月至2012年3月于我院手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織石蠟標(biāo)本98例，術(shù)后病理證實其中62例伴有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有病例術(shù)前均未行放療和化療?；颊呔型暾呐R床及隨訪資料?；颊咧心?6例，女32例;年齡33～76歲，平均年齡(58.2±16.8)歲。以40例結(jié)腸鏡檢查及其他手術(shù)中獲得的正常結(jié)直腸黏膜組織石蠟標(biāo)本為對照。AQP-5、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、MMP-9兔抗人多克隆抗體均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自福建邁新生物公司。

1.2 免疫組化方法及結(jié)果判斷厚約4 μm的石蠟切片脫蠟水化后嚴(yán)格按照免疫組化(SP法)試劑盒說明書進(jìn)行操作。用已知陽性組織切片作為陽性對照，以PBS為陰性對照。根據(jù)組織陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度綜合評分，隨機(jī)取10個400×高倍鏡視野，每視野計數(shù)100個細(xì)胞。AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為染色陽性。計分方法:無陽性細(xì)胞計0分，＜25%計1分，25%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。染色強(qiáng)度計分:未著色0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。根據(jù)樣本陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度計分之和的結(jié)果分為≤3分為弱陽性;≥4分為強(qiáng)陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，組間相關(guān)性采用Spearmann相關(guān)分析，對患者的生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier法統(tǒng)計并繪制生存曲線，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在結(jié)直腸癌中表達(dá)情況AQP-5、MMP-2、MMP-9在結(jié)直腸癌原發(fā)灶中陽性表達(dá)率明顯高于正常結(jié)直腸癌黏膜(P ＜0.05);腫瘤組織TIMP-1、TIMP-2蛋白的陽性表達(dá)率明顯低于正常結(jié)直腸癌黏膜(P＜0.05)。見表1。

表1 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在結(jié)直腸癌組織、正常黏膜中的表達(dá)情況例(%)

2.2 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在結(jié)直腸癌組織表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系收集62例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者資料，按UICC(2009年第7 版)淋巴結(jié)(N)分期的判斷，將淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為N1組(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移＜4枚)和N2組(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移≥4枚)。 AQP-5、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、MMP-9蛋白陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度有明顯關(guān)系，AQP-5、MMP-2、MMP-9蛋白在N2組表達(dá)比N1組增強(qiáng)，而TIMP-1、TIMP-2蛋白則在N1組表達(dá)強(qiáng)于N2組(P＜0.05)。見表2。

表2 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目關(guān)系例(%)

2.3 AQP-5表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系根據(jù)結(jié)直腸癌組織中AQP-5的表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行Kaplan-Meier分析并繪制生存函數(shù)曲線，發(fā)現(xiàn)AQP-5陽性表達(dá)患者的生存率低于陰性患者(χ2= 13.74，P＜0.01)。見圖1。

2.4 AQP-5、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白在結(jié)直腸癌腫瘤中表達(dá)的相關(guān)性在98例結(jié)直腸癌腫瘤中，AQP-5蛋白表達(dá)與MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)性(r=0.276，0.308;P=0.006，0.002)，AQP-5蛋白表達(dá)與TIMP-1、TIMP-2蛋白表達(dá)呈均負(fù)相關(guān)性(r=－0.328，－0.242;P＜0.001，0.016)。TIMP-1蛋白表達(dá)與MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)呈均負(fù)相關(guān)性(r=－0.366，－0.308;P＜0.01)，TIMP-2蛋白表達(dá)與MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)也呈均負(fù)相關(guān)性(r =－0.226，－0.204;P=0.025，0.044)，MMP-2蛋白表達(dá)與MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.407，P＜0.01)。

圖1 結(jié)直腸癌患者AQP-5表達(dá)與預(yù)后關(guān)系的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

結(jié)直腸癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移是多種基因造成的，分子機(jī)制復(fù)雜，確定轉(zhuǎn)移新基因有重要的意義。本研究對與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的新基因水通道蛋白-5(aquaporin-5，AQP-5)的作用和臨床意義進(jìn)行了研究。AQP-5基因在人類定位于染色體12q3，cDNA全長約1.8 kb，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子［7］。AQP-5與多種惡性腫瘤相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)AQP-5在宮頸癌中存在過表達(dá)，與臨床特征及預(yù)后有關(guān)［8］;還有研究表明AQP-5參與順鉑對卵巢癌細(xì)胞的增殖抑制，是卵巢癌的潛在治療靶基因［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)AQP-5在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌的一些病理特征有關(guān)［4］。這些都說明AQP-5表達(dá)增高與腫瘤發(fā)生進(jìn)展關(guān)系密切。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中AQP-5表達(dá)明顯比正常黏膜增強(qiáng)，說明AQP-5參與了結(jié)直腸癌的形成與進(jìn)展;結(jié)果還發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移較多的患者AQP-5表達(dá)更強(qiáng)，提示AQP-5可能對結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，檢測患者腫瘤中AQP-5表達(dá)可能對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有較好的預(yù)測作用。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)AQP-5陽性表達(dá)患者的生存率低于陰性患者，說明AQP-5過表達(dá)是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的因素，提示患者預(yù)后較差。但本研究例數(shù)較少，還需要擴(kuò)大研究規(guī)模對AQP-5的臨床意義予以確定。

為了解AQP-5促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，本研究還檢測了與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達(dá)情況。MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成員，有分解細(xì)胞周圍基質(zhì)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移至其他部位的能力。而MMPs的抑制物TIMPs家族成員則具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的作用，其中主要成員為TIMP-1和TIMP-2。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)高于癌旁正常黏膜，而TIMP-1、TIMP-2存在表達(dá)降低的現(xiàn)象。說明腫瘤組織中MMPs-TIMPs的動態(tài)平衡失調(diào)導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。相關(guān)分析顯示在腫瘤組織中AQP-5與MMP-2、MMP-9存在正相關(guān)關(guān)系，而與TIMP-1、TIMP-2存在負(fù)相關(guān)，提示AQP-5可能通過調(diào)節(jié)下游基因及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方式促進(jìn)MMP-2、MMP-9表達(dá)，同時抑制TIMP-1、TIMP-2表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，并導(dǎo)致結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)AQP-5參與了結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，其機(jī)制可能與AQP-5調(diào)控MMPs和TIMPs家族成員的表達(dá)及功能有關(guān)。AQP-5有可能成為抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的新靶點，并可能作為結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志物及預(yù)后因子。但本研究規(guī)模較小，還有待進(jìn)一步深入研究，通過擴(kuò)大研究規(guī)模、開展分子生物功能實驗等方式闡明AQP-5與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

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Effect and action mechanism of AQP-5 on lymphatic metastasis of colorectal cancer

LV Bonan，SHI Xiaoming，WU Shengchun，et al.Department of General Surgery，Hebei，Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

ObjectiveTo investigate the expression of aquaporin-5(AQP-5)in colorectal cancer，and to analyze the relationship between AQP-5 expression and lymphatic metastasis as well as prognosis of patients.At the same time，to detect the expression of MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 in colorectal cancer in order to explore their significance.M ethodsThe paraffin specimens of 98 cases of colorectal cancer tissues with positive lymph nodes metastasis and 40 cases of tumor adjacent tissues were collected.The expression levels of AQP-5 and MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 proteins were detected by immunohistochemistry(SP)，moreover the patients’clinical data were recorded and the patients were followed up to analyze the correlation between AQP-5 and MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2 proteins Results The expression levels of AQP-5，MMP-2，MMP-9 in tumor tissues were significantly higher than those in tumor adjacent tissues，however，the expression levels of TIMP-1，TIMP-2 in tumor tissues were significantly lower than those in tumor adjacent tissues(P＜0.05).The expression levels of AQP-5，MMP-2 were positively correlated to the numbers of lymph node metastasis(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis showed that the survival time in patients with positive AQP-5 was relatively shorter(P＜0.05).The AQP-5 was closely related with MMP-2，MMP-9，TIMP-1in colorectal cancer tissues(P＜0.05).ConclusionAQP-5 can promote lymph node metastasis of colorectal cancer，and positive AQP is a sign of poor prognosis.AQP-5 may regulate the expression of proliferation-related proteins to realize the effect.

colorectal cancer;aquaporin-5;metastasis，lymph node;prognosis;proteins related to invasion and metastasis

R 735.34

A

1002－7386(2015)03－0346－03

2014－06－11)

10.3969/j.issn.1002－7386.2015.03.006

050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院普外二科