江河，司勇鋒，蘭桂萍，翁敬錦，韋海明

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科，廣西南寧 530021）

微血管及微淋巴管在鼻咽癌組織中表達情況研究*

江河，司勇鋒，蘭桂萍，翁敬錦，韋海明

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科，廣西南寧 530021）

目的：觀察微血管及微淋巴管在鼻咽癌組織中表達情況。方法：63例中晚期鼻咽癌患者隨機分觀察組和對照組，觀察組32例給予rAd－p53瘤內(nèi)注射+同步放化療;對照組31例僅給予同步放化療。采用免疫組化二步法檢測兩組患者癌組織中CD34－MVD、D2－40蛋白等，對比分析兩組。結(jié)果：在鼻咽癌組織中均能觀察到D2－40蛋白和CD34蛋白表達;觀察組患者治療后鼻咽癌組織D2－40蛋白表達明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）;對照組患者治療前后D2－40蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）;觀察組觀察組CD34－MVD的表達較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）;對照組治療前后鼻咽癌組織CD34－MVD的表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）。結(jié)論：D2－40蛋白和CD34蛋白均在鼻咽癌組織中表達，在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。

鼻咽癌;微血管;微淋巴管

鼻咽癌是廣西常見的惡性腫瘤之一，近年發(fā)病呈現(xiàn)逐年上升趨勢，嚴重影響患者身體健康。因此，尋找有效的治療方案和判斷預后的生物學指標是目前臨床研究者關(guān)注的一個熱點。癌細胞轉(zhuǎn)移是鼻咽癌基礎(chǔ)研究和臨床治療的熱點和難點，癌細胞如何通過淋巴管和微血管轉(zhuǎn)移還存在爭議［1，2］。我們通過免疫組化檢測方法了解D2－40蛋白和CD34蛋白均在鼻咽癌組織中表達情況，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料：2007年2月至2010年8月我科收治中晚期鼻咽癌患者63例，其中男52例，女11例，年齡22～6歲，中位年齡42歲。觀察組患者臨床基本資料如性別、年齡、T分期、N分期、臨床分期等與對照組相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），見表1。

表1 觀察組與對照組患者臨床基本資料的比較

1.1.1 納入標準：①年齡20～64歲，性別不限;②符合診斷標準，病理診斷為鼻咽部未分化非角化性癌，未使用抗癌藥物治療;③臨床分期Ⅲ、Ⅳ期;④卡氏評分≥70分;⑤自愿參加并簽署知情同意書。

1.1.2 排除標準：①不符合納入標準;②癌細胞遠處轉(zhuǎn)移;③合并其他嚴重感染者;④研究期間使用其他抗腫瘤藥物進行治療;⑤合并其他嚴重疾病如急性腦卒中、腦出血、精神病患者、肝腎功能嚴重損傷者。

1.1.3 剔除標準：①患者治療依從性差;②患者治療期間出現(xiàn)不良事件，經(jīng)評估不適合繼續(xù)參加研究;③使用rAd－p53出現(xiàn)不耐受的不良反應(yīng)。

1.2 治療方法

1.2.1 對照組：僅給予同步放化療，其中放射治療操作及劑量為：采用直線加速器對鼻咽部進行常規(guī)照射，放射總劑量控制在70～76Gy，放射療程為7～8周，共進行35次放射治療，對于頸部轉(zhuǎn)移的腫瘤病灶可將放射總劑量控制在60～70Gy。化療操作及劑量：一般采用卡鉑+5－Fu方案。卡鉑劑量500mg/m2，一次給藥，加入5%葡萄糖注射液250mL中靜脈滴注。5－Fu劑量500mg/m2，每天1次，加入5%葡萄糖注射液1000mL中靜脈緩慢滴注，總量5g為一個療程，與放療同步進行，21d后重復化療1次，共2個周期。

1.2.2 觀察組：給予rAd－p53瘤內(nèi)注射+同步放化療，rAd－p53使用方法：1支(1×1012病毒單位，中國深圳賽百諾公司生產(chǎn)，批號S20080831）使用生理鹽水稀釋2mL后在鼻內(nèi)鏡直視下進行鼻咽部多點原發(fā)病灶瘤體內(nèi)注射，每周1次，連用8周。放化療與對照組相同。1.3實驗方法

1.3.1 微血管：采用免疫組化Elivision TM plus二步法檢測兩組患者治療前后原發(fā)病灶腫瘤組織中的CD34蛋白和微血管MVD計數(shù)。檢測所需的試劑盒(由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)）DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司生產(chǎn)），CD34蛋白抗體(北京中杉生物技術(shù)公司生產(chǎn)）。實驗步驟：經(jīng)病理確認的標本用4%甲醛固定，然后進行脫水，使用石蠟包埋技術(shù)處理，然后切片，采用Elivision TM plus二步法，按照試劑內(nèi)置的說明書操作進行CD34蛋白檢測。使用已知道的CD34蛋白陽性切片作為陽性對照，使用PBS代替陰性對照，進行切片確認。

1.3.2 淋巴管：試驗試劑：免疫組化ElivisionTM plus二步法試劑盒(由福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)），DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司生產(chǎn)），D2－40單克隆抗(北京中杉生物技術(shù)公司生產(chǎn)）。實驗步驟：經(jīng)病理確認的標本用4%甲醛固定，然后進行脫水，使用石蠟包埋技術(shù)處理，然后切片，采用Elivision TM plus二步法，按照試劑內(nèi)置的說明書操作進行D2－40蛋白檢測。

1.4 結(jié)果判斷

1.4.1 微血管：CD34－MVD：采用Weidner方法，即先在40倍鏡下選擇高血管密度區(qū)(熱點區(qū)）計數(shù)，然后在200倍視野下計數(shù)被染成棕黃色的血管數(shù)目。

1.4.2 微淋巴管：D2－40陽性表達于淋巴管內(nèi)皮細胞胞膜和胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。微淋巴管計數(shù)(MLVD）方法采用Weidner法計數(shù)：先在低倍鏡下尋找新生脈管最密集的區(qū)域即熱點(hotspot），然后在高倍鏡下對淋巴管進行計數(shù)，在腫瘤組織內(nèi)以5個高倍鏡視野脈管的平均數(shù)表示微淋巴管(MLVD）。

1.5 隨訪：采用患者定期回院復查和由專門隨訪員電話進行隨訪，隨訪時間從2007年10月至2012年3月，隨訪資料錄入epdata3.1數(shù)據(jù)庫。

1.6 統(tǒng)計學方法：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對整理的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料組間的比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗分析，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 D2－40蛋白在鼻咽癌組織中的表達情況：D2－40標記的淋巴管呈一致性的官腔結(jié)構(gòu)，呈棕黃色染色，表現(xiàn)為一層薄壁，管腔內(nèi)很少有淋巴細胞，無紅細胞，見圖1。

圖1 D2－40蛋白在鼻咽癌組織中的表達(SP×200）

2.2 CD34蛋白在鼻咽癌組織中的表達情況：CD34標記的微血管可見染色清晰的血管內(nèi)皮細胞，呈棕黃色至深褐色彌散性分布，官腔大小不一，見圖2。

圖2 CD34蛋白在在鼻咽癌組織中的表達(SP×200）

2.3 兩組患者治療前后D2－40蛋白的表達情況的比較：觀察組患者治療后鼻咽癌組織D2－40蛋白表達明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）;對照組患者治療前后D2－40蛋白表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），見表2。

表2 兩組患者治療前后D2－40蛋白的表達情況的比較

2.4 兩組患者治療前后CD34－MVD表達情況的比較：觀察組CD34－MVD的表達較治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）;對照組治療前后鼻咽癌組織CD34－MVD的表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）對照組，見表3。

表3 兩組患者治療前后CD34－MVD的表達情況的比較

3 討論

鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個復雜有序的過程，期間存在細胞粘附性下調(diào)、基質(zhì)降解和遷移能力增強等多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時新生淋巴管和新生微血管提供腫瘤生長所需物質(zhì)，并通過血液循環(huán)和淋巴循環(huán)將原發(fā)癌細胞輸送到轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和遠處把器官。大量臨床研究表明，鼻咽癌細胞主要通過淋巴系統(tǒng)進行擴散和轉(zhuǎn)移，目前常見的淋巴管特異性標志物有腎小球足突細胞膜粘蛋白(D2－40）、血管內(nèi)皮生長因子受體－3(VEGFR－3）等［3～5］。近年來的研究表明，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管生成。微血管密度(MVD）是目前檢測鼻咽癌腫瘤血管形成的一個重要指標，檢測抗CD34抗體標記的微血管密度是判斷腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移的有效指標［6］。

本研究結(jié)果顯示，D2－40蛋白和CD34蛋白均在鼻咽癌組織中表達，提示我們根據(jù)這些指標的變化可以評估鼻咽癌的治療效果。江河等［7］人研究結(jié)果示，D2－40與癌組織遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，D2－40蛋白表達降低，MLVD數(shù)量下降，遠處轉(zhuǎn)移風險低。周日晶等［8］人研究結(jié)果顯示，鼻咽癌患者CD34蛋白表達降低，MVD數(shù)量下降，降低了癌組織向遠處轉(zhuǎn)移的風險。研究也顯示，在治療前后的比較研究中，觀察組患者D2－40蛋白表達下降明顯，而對照組無明顯變化，提示我們rAd－p53瘤內(nèi)注射+同步放化療效果明顯優(yōu)于單純同步放化療，觀察組患者D2－40蛋白表達低，說明該治療方案能明顯抑制癌組織淋巴內(nèi)皮細胞和淋巴管生成。另外，研究結(jié)果也顯示，觀察組CD34－MVD的表達較治療前明顯下降，而對照組CD34－MVD的表達治療前后無明顯下降。提示我們rAd－p53瘤內(nèi)注射+同步放化療方案不僅能抑制淋巴內(nèi)皮細胞及淋巴管生成，同時也能抑制癌組織微血管的形成，研究文獻亦證實本研究結(jié)果。

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10.3969/j.issn.1006－6233.2015.06.034

1006－6233(2015）06－0975－04

廣西壯族自治區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生重點科研課題，(編號：200721）