樊紅，邵雪齋，張玉娟

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北承德 067000）

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因和血管內(nèi)皮細胞因子在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及意義

樊紅，邵雪齋，張玉娟*

(承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北承德 067000）

目的：檢測PTTG及VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜及對照組正常內(nèi)膜的表達，并探討其相關性。方法：選取52例子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜、44例在位內(nèi)膜，27例正常子宮內(nèi)膜組織為對照組。用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT－PCR）及免疫組化(SP）方法測PTTG、VEGF在三組中的表達情況。結(jié)果：PTTG mRNA在子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜組表達高于在位內(nèi)膜組，在位內(nèi)膜組表達高于正常子宮內(nèi)膜組織(P＜0.01，P＜0.01）。PTTG蛋白表達在異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、正常內(nèi)膜組的陽性率分別為：90%、79%、22%，異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組表達均高于正常子宮內(nèi)膜組織(P＜0.01，P＜0.01）。VEGF蛋白表達在異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組、正常內(nèi)膜組的陽性率分別為： 90%、84%、59%，異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組表達高于正常子宮內(nèi)膜組織(P＜0.01，P＜0.01）。等級相關分析PTTG表達與VEGF表達呈正相關關系。結(jié)論：子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組均有PTTG mRNA及PTTG蛋白表達;且異位內(nèi)膜組表達均顯著高于在位內(nèi)膜組及正常組;異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組中VEGF表達高于正常子宮內(nèi)膜組織;PTTG高度表達可上調(diào)VEGF高表達，PTTG與VEGF呈正相關表達，提示子宮內(nèi)膜活性增強、侵襲力增高，可促進血管形成。

子宮內(nèi)膜異位癥EMs;垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因PTTG;血管內(nèi)皮生成因子VEGF;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應RT－PCR;免疫組織化學SP

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMT）指有生長活力的子宮內(nèi)膜組織(腺體或間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮以外部位，常侵犯器官為卵巢，形成卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫，雖為良性疾病，但病理上具有類似惡性腫瘤行為，與新生血管形成有密切關系。近些年其發(fā)病率及復發(fā)率明顯上升［1］。幾十年以來，通過實驗技術的提高和新的研究，內(nèi)異癥傾向于是一種子宮內(nèi)膜疾病、干細胞疾病和類腫瘤疾?。?，3］。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(Pituitary Tumor Transforming gene，PTTG）又稱封閉素，是強有力的原癌基因，可參與細胞周期增殖、轉(zhuǎn)化重建細胞外基質(zhì)等作用，和腫瘤的血管形成及侵襲性有密切關系。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結(jié)合生長因子，可直接或間接的作用與血管內(nèi)皮細胞，導致血管新生。本研究探討以上指標在子宮內(nèi)膜異位癥中形成血管機制，及它們之間的相關性，可用于指導臨床治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料：選取2013年9月至2014年6月在承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院婦科患有EMs住院手術的患者。其中52例為EMs患者的異位內(nèi)膜，依據(jù)美國生育協(xié)會(r－AFS）分期標準，其中Ⅰ～Ⅱ期16例，Ⅲ～Ⅳ36例;44例在位內(nèi)膜，其中增殖期內(nèi)膜25例，分泌期內(nèi)膜19例;27例非內(nèi)異癥患者的正常子宮內(nèi)膜，其中增生期21例，分泌期6例。年齡在22～43歲，平均年齡為32歲，兩組患者月經(jīng)規(guī)律(28～32d），術前6個月無激素治療、無哺乳史，無內(nèi)外科疾病。正常子宮內(nèi)膜選取同期患有子宮肌瘤、功血等行子宮全切術患者。所有標本經(jīng)過我院病理科檢查確診。標本為手術離體后立刻獲取，一份經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片為4um厚度，用于免疫組化染色。另一份取100mg快速放入液氮中準備提取RNA用。

1.2 實驗試劑：Trizol試劑購自Inuitrogen公司，PTTG AMV第一鏈cDNA合成試劑盒，2×Tap PCR Master Mix試劑購自上海生工生物工程。PTTG、VEGF兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物。

1.2.1 PTTG mRNA表達：采用RT－PCR法，用Trizol一步法提取總RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，擴增片段為145bp，β－actin作為內(nèi)參照基因為564bp與Genebank所載相符。PTTG基因上游引物(5‵→3‵）：TAG TCC TTG ACG AGG GAG;下游引物(5‵→3‵）：GGTGGC AAT TCA ACA TCC AGG;βactin內(nèi)參上游引物(5‵→3‵）CTG GGA CGA CAT GGA GAA AA;下游引物(5‵→3‵）：AAG GAA GAA GGC TGG AAG AGT GC。取PCR產(chǎn)物10ul用經(jīng)EB染色后的1%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外熒光數(shù)字成像儀下照像并進行光密度定量分析。以每例PTTG與相應β－actin擴增產(chǎn)物條帶累及光密度(IOD）的比值作為PTTGmRNA的相對表達量。

1.2.2 免疫組化：PTTG、VEGF蛋白表達：采用免疫組化Maxvision法，嚴格按試劑盒說明書操作，結(jié)果判定： PTTG及VEGF主要表達于細胞質(zhì)或細胞核(大多數(shù)在細胞質(zhì)）以其出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應。于染色均勻的腫瘤區(qū)選取個高倍鏡(×400）視野，采用Volm雙評分法判定結(jié)果：①陽性結(jié)果百分率(A值）評分：＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分;②染色強度(B值）評分：不著色為0分，淺棕色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。A+B為0分判斷為陰性(－），1～2分為+(弱陽性），3～4分為++(中度陽性），5～6分為+++(強陽性）。

1.2.3 相關性分析：分析上述指標在內(nèi)異癥中異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組及正常內(nèi)膜組的表達，各指標與內(nèi)膜變化和手術分期表達的相關性。

1.3 統(tǒng)計學方法：運用SPSS統(tǒng)計17.0軟件包進行分析，計量資料采用單因素方差分析，等級資料采用非參數(shù)Kruska1－Wallis檢驗，相關分析用Spearman秩相關。

2 結(jié)果

2.1 PTTGmRNA表達：EMs中異位內(nèi)膜組織中PTTG mRNA表達量明顯高于在位內(nèi)膜組織和正常子宮內(nèi)膜組織，其相對表達量分別為：1.02±0.99、0.77±0.10、0.59±0.12(P＜0.01，P＜0.01）。在位內(nèi)膜組織增生期高于分泌期PTTGmRNA相對表達量(P＜0.01）;正常內(nèi)膜組織中增生期和分泌期相對表達量差異無統(tǒng)計學意義。三組間PTTG mRNA比較有意義(見表1，見圖1）。

2.2 PTTG蛋白表達：PTTG蛋白主要表達于腺上皮細胞胞漿，間質(zhì)細胞未見明顯表達。EMs中異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜、正常子宮內(nèi)膜PTTG蛋白表達陽性率有逐漸升高趨勢，分別為90%、79%、22%。三組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.01），其中異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組表達強度高于正常內(nèi)膜組(P＜0.01，P＜0.01），正常內(nèi)膜組及在位內(nèi)膜組中，PTTG在增殖期與分泌期的陽性表達率無統(tǒng)計學差異(P＞0.05）。

2.3 VEGF蛋白表達：VEGF蛋白在三組中主要表達于內(nèi)膜的腺上皮細胞、間質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞的胞漿和胞膜上，腺上皮細胞表達強于間質(zhì)細胞，EMs中異位內(nèi)膜組織、在位內(nèi)膜組織、正常子宮內(nèi)膜VEGF的蛋白表達陽性率分別為：90%、84%、59%，(P＜0.01，P＜0.01），三組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01）其中異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組表達強度高于正常內(nèi)膜組(P＜0.01），有統(tǒng)計學意義;正常內(nèi)膜組及在位內(nèi)膜組中VEGF中分泌期內(nèi)膜高于增殖期內(nèi)膜(P＜0.01）。

2.4 各項指標表達的相關性：PTTG與VEGF表達呈正相關，(r值為0.73，P＜0.001），隨著PTTG陽性表達增強，VEGF表達也顯著增強。

表1 PTTG mRNA在三組間的表達

表2 PTTG蛋白在三組間的表達

表3 VEGF蛋白在三組間的表達

圖1 PTTGmRNA在三組中的表達：1～2正常內(nèi)膜組織，3～4在位內(nèi)膜組織，5～6異位內(nèi)膜組織

圖2 PTTG在子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜組的表達(SP染色×200）

圖3 VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥中異位內(nèi)膜組的表達(SP染色×200）

3 討論

大量的研究證實，EMs需要依賴于血管生成［4］，VEGF又稱血管通透因子，是新發(fā)現(xiàn)的一種多肽類生長因子，來源于腹腔里面活化了的巨噬細胞，是眾多血管內(nèi)皮因子中作用最強的一個因子［5］。VEGF家族有5個成員，分別為VEGF－A、B、C、D和胎盤生長因子(PLGF），其受體有Fit－1和fik－1/KDR，屬于酪氨酸激酶受體家族第三亞型。VEGF主要的生物功能是：①直接促進血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂、增生、遷移，并形成血管;②增加血管通透性，使血管芽延伸生長;③其受體在形成血管管腔時發(fā)揮效應。正常人體中可以存在血管內(nèi)皮生長因子，我們研究正常子宮內(nèi)膜中存在VEGF基因，由于月經(jīng)周期變化，分泌期子宮內(nèi)膜較增殖期內(nèi)膜高，但兩者之間無統(tǒng)計學意義。VEGF與其受體始終保持者平衡關系，當這種平衡被打破后則形成新生血管。在本實驗中，異位內(nèi)膜組織中的VEGF表達高于在位內(nèi)膜和正常內(nèi)膜，從而看到異位內(nèi)膜更具有新生活力，才能在其部位形成病灶。VEGF基因在內(nèi)異癥中受多種因素、因子共同致病。VEGF在內(nèi)異癥中Ⅰ～Ⅱ期較Ⅲ～Ⅳ期陽性表達高，推斷在早期內(nèi)異癥中在位的內(nèi)膜受VEGF高表達使其內(nèi)膜的活性更高，導致疾病更進一步發(fā)展。

垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG）是1997年Lin Pei［6］等利用差異顯示PCR技術分離出來的，在體外將轉(zhuǎn)染的PTTG成纖維細胞種植于無胸腺裸鼠皮下3周后形成腫瘤。利用原位雜交、免疫組化等技術發(fā)現(xiàn)PTTG位于細胞質(zhì)，部分位于細胞核中。PTTG在大多數(shù)正常成人組織中檢測不到，在高增殖活性的胚胎肝、胸腺、睪丸以及被研究的腫瘤細胞中呈高表達。PTTG高度表達在腫瘤發(fā)生的作用機制可能是：①導致細胞周期性增殖，通過SH－3介導的細胞內(nèi)信號通路使細胞轉(zhuǎn)化;②通過激活轉(zhuǎn)染并反式激活細胞中的原癌基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，致腫瘤形成;③PTTG蛋白抑制姐妹染色體單體分離，使染色體穩(wěn)定性破壞，非整倍體形成的雙重作用導致腫瘤形成;④可通過誘導P53的細胞凋亡，使基因調(diào)控區(qū)失常，導致腫瘤形成。⑤通過促進bFGF、VEGF參與的腫瘤血管生成［7］。

目前PTTG基因在EMs中的表達和意義與VEGF關系文獻報道極少。通過本實驗結(jié)果，推斷PTTG與VEGF之間的關系：①PTTG高度表達可誘導EMs的血管新生。Ishikaw等［8］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的NH 3T3細胞的培養(yǎng)液中VEGF表達增加，在體外實驗表明，這種培養(yǎng)基在體外能誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移、毛細血管和管腔形成。在體內(nèi)能誘導雞胚絨毛膜尿囊膜形生輪輻狀外觀，是新生血管的表現(xiàn)。本實驗中發(fā)現(xiàn)PTTGmRNA和PTTG蛋白表達在EMs中異位內(nèi)膜組及在位內(nèi)膜組中均有高度表達，正常內(nèi)膜組有6例呈弱陽性表達。②Kim［9］等在甲狀腺腫瘤中的實驗中證實，ID 3 (血管生成基因）和VEGFmRNA的表達有關。利用外源性VEGF刺激FTC133細胞能夠增強ID3和VEGF的表達，用TR－PCR等技術在研究中發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體KDR/FIK－1含量比相應正常組織顯著升高，與PTTG呈正相關。本實驗中同樣證實，EMs中PTTG mRNA及PTTG蛋白表達在異位內(nèi)膜組、在位內(nèi)膜組中有高度表達，并與VEGF表達在異位內(nèi)膜組和在位內(nèi)膜組呈正相關。進一步肯定PTTG高度表達可上調(diào)VEGF因子促進EMs血管生長并有侵襲和種植有關。但是PTTG mRNA和蛋白水平同時顯示在Ⅰ、Ⅱ期及Ⅲ、Ⅳ期無明顯差異，推測PTTG在內(nèi)異癥中不隨期別的增加，而表達增高，可能是EMs中細胞分化正常，不同與惡性腫瘤細胞的分化。③EMs形成機制中可通過淋巴管通路形成微血管。研究中發(fā)現(xiàn)PTTG誘導VEGF高度表達的作用機制相同：MAPK級聯(lián)活化增強PTTG反式激活作用，促進PTTG轉(zhuǎn)移入核內(nèi)，結(jié)合于VEGF轉(zhuǎn)錄起始位點，激活VEGF轉(zhuǎn)錄、翻譯、促進腫瘤微血管生成。④在研究垂體腫瘤發(fā)生過程中，發(fā)現(xiàn)PTTG受雌激素調(diào)控，給予雌激素后PTTG表達水平以時間和劑量依賴性反式明顯升高，并促使VEGF的表達。給予雌激素抗體時PTTG mRNA明顯下降和腫瘤體積縮小。而本研究結(jié)果顯示，在EMs中在位內(nèi)膜中PTTG在增殖期與分泌期相比，差異無統(tǒng)計學意義，說明PTTG的表達不受卵巢性激素的影響。⑤近年來研究表明，MMP家族是一類蛋白水解酶，在EMs中血管形成和轉(zhuǎn)移種植中不可缺少的一類細胞外基質(zhì)重塑的因子。MMP和TIMP在EMs中的異常表達和EMs的發(fā)生發(fā)展有關，在裸鼠中注射了高度表達的PTTG的HEK293細胞，產(chǎn)生的腫瘤中MMP－2的表達、分泌及其功能比正常組織升高了，進一步加入MMP－2抗體后該作用顯著下降了，由此推斷PTTG可通過下調(diào)TIMP－1和TIMP－2的分泌來增強MMP－2的表達。

［1］王爽，張曉玲.Ang－2、VEGF在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥中表達及相關性研究［J］.實用婦產(chǎn)科雜志，2010，26(8）：594～ 597.

［2］郎景和.子宮內(nèi)膜異位癥研究的深入和發(fā)展［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2010，45(4）：241～242.

［3］石一復，郝敏.子宮內(nèi)膜異位癥診療新進展［M］.人民軍醫(yī)出版社，2014.19～23.

［4］Machado DE，Berardo PT，Landgraf RG，etal.A selective cyclooxygenase－2 inhibitor suppresses the growth of endometrionsis with an antiangiogenic effect in a rat mode［J］.Fertil Steril，2010，93(8）：2674～2679.

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The Expression and Significance of PTTG and VEGF in EMT

FAN Hong，SHAO Xuezhai，ZHANG Yujuan
(The Affiliated Hospital to Chengde Medical College，Hebei Chengde 067000，China）

Objective：To discuss the expression and correlation of PTTG and VEGF between ectopic EMT，EMT for patients with endometriosis and normal EMT for those without endometriosis.Method：Tobuild up one control group： 52 cases of ectopic EMT for patientswith endometriosis， 44 cases of EMT and 27 cases of normal EMT.Detecting the expression of PTTG and VEGF in 3 groups respectively，by way of RTPCR and SP.Result：The PTTGmRNA of ectopic EMT for patientswith endometriosiswas obviously higher than EMT and normal EMT group(P＜0.01），EMT was higher than normal EMT(P＜0.01）.Positive rate of PTTG protein expression for ectopic EMT，EMT and normal EMT group are 90%，79%and 22%respectively(P＜0.01）.Positive rate of VEGF protein expression for ectopic EMT，EMT and normal EMT group were 90%，84%and 59%respectively.A positive correlation was found between the expression of PTTG and VEGF.Conclusion：Both ectopic EMT and EMT group for patientswith endometriosis have the PTTGmRNA and PTTG protein expression;besides，expression of ectopic EMT for patients with endometriosis is higher than those in the EMT and normal EMT group;VEGF expression in the ectopic EMT group is higher than that in the EMT group;while the VEGF expression in the EMT group is higher than that in normal EMT group;PTTG high expression can raise VEGF high expression，PTTG and VEGF are positively correlated，which can promote the tumor angiogenesis and development of disease.

Endometriosis(EMT）;Pituitary tumor transforming gene(PTTG）;Vascular endothelial generated factor(VEGF）;Reverse transcription polymerase chain reaction(RT－PCR）;Immunohistochemical(SP）

A

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.06.006

1006－6233(2015）06－0897－05

*通訊作者，Email：zhangyj007@sin.cn