方琳琳,宋瀏偉,楊 林,吳 勇,袁 權,夏寧邵

(廈門大學公共衛(wèi)生學院,國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心,福建廈門361101)

利用Gibson Assembly技術構建乙型肝炎病毒1.1倍體復制子

方琳琳,宋瀏偉,楊 林,吳 勇,袁 權*,夏寧邵

(廈門大學公共衛(wèi)生學院,國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心,福建廈門361101)

乙型肝炎病毒(HBV)基因組各開放閱讀框高度重疊,因此構建可在體外細胞模型中復制的HBV DNA質粒至少要包含1.1倍以上的HBV基因組.構建HBV1.1倍體復制子的傳統(tǒng)克隆方法涉及多步DNA酶切/連接,操作復雜,耗時較長.本研究發(fā)展了基于新型克隆技術Gibson Assembly構建HBV1.1倍體復制子質粒的新方法,在獲得HBV基因組DNA后僅需1步體外裝配即可完成,利用這一方法,本研究成功從4份HBV感染者標本中獲得HBV1.1倍體復制子,并通過瞬時轉染Huh7細胞,證明其能夠支持HBV的體外復制.本研究為從臨床標本中快速獲得HBV復制子克隆以研究病毒表型功能提供了更為高效的新方法.

乙型肝炎病毒;Gibson Assembly;1.1倍體

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題之一[1].它通過血液、體液等傳播,HBV感染可導致急性或者慢性感染,急性感染有可能引起暴發(fā)性肝病,導致死亡,而對于慢性感染人群,則患肝硬化或肝癌的概率大大上升,全球慢性乙肝患者已經(jīng)超過2億4千萬人,每年大約有60萬人死于HBV感染相關疾病[2].中國是HBV高流行區(qū),有近1億HBV攜帶者,其中每年新發(fā)HBV感染達10萬以上,慢性乙型肝炎患者高達3 000萬人[3],多種肝臟疾病與HBV的持續(xù)感染相關,例如,原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),其發(fā)病率和死亡率分別位于全球惡性腫瘤的第五位和第三位,在我國癌癥死亡率中排名第二[4-5].因此,對HBV的預防和治療研究任重而道遠.

HBV為正嗜肝DNA病毒屬[6],其基因組大小約3.2 kb,為部分雙鏈的松弛環(huán)狀DNA,共包含4個開放閱讀框(open reading frames,ORF),即S-ORF、PORF、C-ORF、X-ORF,4種ORF分別有各自的啟動子.其中S-ORF分別編碼3個包膜蛋莊:L-HBsAg (編碼序列:nt2854-nt3221/1-nt832)、M-HBs Ag(編碼序列:nt3211-nt3221/1-nt832)和S-HBsAg(編碼序列:nt155-nt832);C-ORF編碼Pre-Core蛋莊(HBe Ag,編碼序列:nt1814-nt2456)和Core蛋莊(HBc Ag,編碼序列:nt1901-nt2456),HBe Ag是一種分泌型蛋莊,在慢性感染中起到耐受宿主免疫應答的作用,Pre-Core組成病毒Capsid,并包裹病毒基因組.由于HBV基因組結構緊密,高度壓縮,重復利用,不同編碼基因相互重疊,啟動子和增強子等調(diào)控序列又位于編碼基因之內(nèi),ORF分布于全長DNA,某個部位的基因突變將影響多個基因的表達,因此需要含大于3.2 kb的HBV基因序列的載體才能在轉染細胞內(nèi)建立HBV的復制狀態(tài)[7].通常需要構建HBV1.1或者以上倍體復制子用于病毒功能的研究.

本實驗利用新型克隆技術“Gibson Assembly”[8],從臨床標本中構建了HBV1.1倍體復制子,并轉染Huh7細胞驗證其功能;避免了傳統(tǒng)方法中多步酶切等繁復的實驗步驟,大大提高了克隆構建的效率,為HBV臨床研究和病毒功能研究提供了更快速高效的方法.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 HBV陽性血清

4份HBs Ag陽性標本來自西藏林芝醫(yī)院(血清樣本的處理及病毒DNA提取均在P2級病毒室操作).標本的基本信息如表1所示.

1.1.2 質粒、菌株及主要試劑

真核表達載體p TT22E由實驗室自己構建; PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase為大連寶生物(TaKaRa)公司產(chǎn)品;QIAamp DNA Blood MiniKit試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品;感受態(tài)細胞DH5α、質粒小提試劑盒(離心柱型)、瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒(離心柱型)均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品(TIANGEN);Gibson Assembly?Master Mix為紐英倫(NEW ENGLAND Bio Labs)生物技術有限公司產(chǎn)品;Turbofect Transfection Reagent為MBIFermentas公司的產(chǎn)品.

1.1.3 細胞內(nèi)顆粒中DNA提取所需試劑

除了QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品以外,還需以下試劑:PBS溶液:20 mmol/L NaCl,2.68 mmol/L KCl,10 mmol/L Na2HPO4,1.76 mmol/L KH2PO4;細胞裂解液:10 mmol/L TB8.0,1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 2%(質量分數(shù))蔗糖,1%(質量分數(shù))非離子變性劑乙基苯基聚乙二醇(NP40).

1.2 方 法

1.2.1 引物設計

根據(jù)GenBank中HBV全基因序列設計PCR所需引物.另外,根據(jù)Gibson Assembly的引物設計原則,為了保證引物特異性,特異性結合區(qū)設為18～25個堿基,在引物的5′端加入交疊序列.交疊序列與臨近序列的末端同源,交疊序列的長度≥20 bp.

引物Ec1816F/n224R用于擴增A片段,引物n199F/Hd2049R用于擴增B片段.p TT1369F、p TT1342R分別為擴增載體的上下游引物,S3、S4分別為鑒定上下游引物,所有引物均由上海英駿生物技術有限公司合成.引物序列如表2(下劃線部分為相應酶切位點).

1.2.2 標本的處理及血清HBV DNA提取

標本于ˉ20℃保存,檢測前取出自然化凍,去血清標本200μL,用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取,按照核酸提取試劑盒說明書中的步驟進行操作,最后得到100μL血清DNA提取物溶液.

表1 臨床樣本具體信息Tab.1 Sample demographic and clinical characteristics

表2 PCR分段擴增HBV基因組所用引物(I)、擴增載體所用引物(II)以及鑒定引物(III)Tab.2 Primers used for HBV DNA amplification(I),primers used for vector amplification(II)and primers for identification(III)

1.2.3 A、B片段的擴增

以血清中提取的HBV DNA為模板,以Ec1816F、n224R為引物擴增A片段,以n199F、Hd2049R為引物擴增B片段.采用高保真性聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase進行PCR擴增, PCR反應體系為50μL,反應體系包括5×Prime-STAR GXL Buffer 10μL,d NTP混合液(2.5 mmol/ L)4μL(終濃度0.2 mmol/L),引物各1μL(終濃度0.4μmol/L),PrimeSTAR?GXL酶1μL,HBV DNA 5μL,補加超純水至50μL;擴增條件:98℃預變性10 min;98℃變性30 s,58℃退火30 s,68℃延伸2 min,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min.用1.5% (質量分數(shù),下同)的瓊脂糖凝膠于TAE緩沖液中電泳回收PCR產(chǎn)物,采用TIANGEN公司生產(chǎn)的DNA回收試劑盒,按其說明書使用回收.

1.2.4 載體的制備

用PCR擴增出線性載體再用Dpn1處理的方法制備.以p TT22E質粒作為模板,以p TT1369F、p TT1342R為引物,采用高保真性聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase擴增載體,擴增條件:98℃預變性10 min;98℃變性30 s,58℃退火30 s,68℃延伸6 min,30個循環(huán);最后72℃延伸10 min.之后,用Dpn1處理,1μL Dpn1+1μL Dpn1 Buffer/50μL的比例,37℃反應60 min,80℃5 min使Dpn1失活.用1%的瓊脂糖凝膠于TAE緩沖液中電泳回收PCR產(chǎn)物,采用TIANGEN公司生產(chǎn)的DNA回收試劑盒,按其說明書使用回收.

1.2.5 pTT22E-1.1HBV克隆的構建

Gibson Assembly是Dr.Daniel Gibson發(fā)展出的體外高效快速合成DNA的新方法,現(xiàn)被廣泛應用于分子克隆的構建,尤其是大片段及多片段的分子克隆構建.其原理如圖1(a)所示,Gibson Assembly的體系主要由T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase、Taq DNA ligase 3種核心酶組成.T5 exonuclease具有5′-3′DNA外切酶活性,制造載體與片段或片段與片段之間的互補末端;Phusion DNA polymerase具有3′-5′DNA聚合酶活性,互補單鏈退火后將缺口補齊; Taq DNA ligase具有連接酶活性,將兩條單鏈間切口連接.利用這3種酶和緩沖液按一定比例配成預混液,即可實現(xiàn)50℃一步反應的目的[8].同時,Gibson Assembly合成的DNA沒有缺口或切口,不依賴大腸桿菌(Escherichia coli)的修復,因此效率高,可在轉化前跑膠鑒定組裝是否成功.

根據(jù)圖1(b)中所示的流程圖,在獲得片段和載體之后,將片段1、2與載體進行Gibson Assembly,體系為:2×Gibson mix為4μL,片段A、B分別為1.5μL,載體為1μL,50℃反應1 h.連接產(chǎn)物直接做轉化,用TIANGEN公司的DH5α感受態(tài).挑取單菌落,接種于5 m L LB/AMP+液體培養(yǎng)基中,180 r/min,37℃過夜培養(yǎng).用引物S3、S4進行菌液PCR鑒定,挑選菌液PCR陽性的提質粒,電泳,通過質粒大小鑒定是否插入了外源片段.

1.2.6 核苷酸測序鑒定

將PCR鑒定陽性的克隆送上海Invitrogen公司進行核酸序列測定.在美國Applied Biosystem公司生產(chǎn)的3730自動測序儀上分段進行測序.

1.2.7 轉染Huh7細胞

人肝癌細胞株Huh7細胞來自于本實驗室,轉染前,將細胞培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))胎牛血清的基礎培養(yǎng)基(DMEM),于轉染前1 d轉至十二孔板培養(yǎng),按照Turbofect的轉染方法說明,將上述HBV體外重組質粒與GFP質粒(m(HBV質粒)∶m(GFP質粒)=9∶1)共轉轉染人肝癌細胞株Huh7.4 d后收集細胞上清,利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液的HBs Ag與HBe Ag水平.

1.2.8 細胞內(nèi)病毒顆粒中DNA的定量檢測

根據(jù)之前的報道,用PEG8000沉淀HBV core,提取core DNA[9],并用實時熒光定量PCR檢測HBV DNA[10].

2 實驗結果

用Gibson Assembly的方法構建1.1倍體時,一些重要步驟所對應的結果如圖2所示,先用PCR的方法獲取載體,然后用Dpn1消化后,采用柱法回收.處理完的載體,與回收好的2個片段,一起進行50℃Gibson Assembly后,轉化、涂板、挑菌并鑒定即可獲得目的克隆.

2.1 兩片段PCR擴增結果

按前述PCR反應體系及反應條件,獲得PCR產(chǎn)物,將其在1.5%和1%的瓊脂糖凝膠中電泳,藍光燈下觀察到約1.6和1.9 kb的條帶(片段1和2),以及6 kb的條帶(載體).結果與預期片段大小相符(圖2(a)和(b)).

圖1 Gibson Assembly原理示意圖(a)和Gibson Assembly構建1.1倍HBV感染性克隆流程圖(b)Fig.1 Overview of the Gibson Assembly method(a)and diagram for process of the cloning(b)

2.2 Gibson Assembly質粒鑒定

2.2.1 PCR鑒定結果

以p TT22E-1.1HBV為模板,PCR擴增S片段,擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,可得到500 bp的片段,與預計片段大小相符,說明從臨床樣本中PCR得到的1.1倍的HBV DNA已和載體連接,亦即HBV1.1倍體復制子已經(jīng)構建成功.如圖2(c)所示。

2.2.2 測序分析

測序結果經(jīng)核對后完全正確,也進一步證實插入的基因片段方向及核昔酸序列正確.

測序結果已提交GenBank后獲得的收錄號分別為:KP276253、KP276254、KP276255、KP276256(分別來自表1中的編號1874、1887、1888、1925).

2.3 構建質粒轉染Huh7

根據(jù)測序結果,選擇沒有突變的質粒,將此HBV體外重組質粒與GFP共轉到人肝癌細胞株Huh7中,轉染2 d后熒光顯微鏡觀察,結果如圖3(a)所示,另單轉GFP質粒用以質控轉染效率,如圖3(b)所示.轉染4 d后收集細胞上清,檢測其HBs Ag與HBe Ag,結果發(fā)現(xiàn)均呈陽性,如圖4(a)和(b)所示;并裂解細胞,提取胞內(nèi)的HBV病毒顆粒中的DNA,進行HBV DNA的定量.

再經(jīng)過細胞數(shù)量及轉染效率的標化后獲得如圖4 (c)所示的每個細胞中的病毒拷貝量的結果.結果顯示,除編號1874對應的樣本相對較低外,其余3株1.1倍克隆均能在細胞中有效復制.

圖2 用Gibson Assembly方法構建HBV 1.1倍體復制子Fig.2 Construction of 1.1-fold-overlength genome plasmids by Gibson Assembly

圖3 1.1倍HBV重組質粒與GFP共轉Huh7 2 d后得到的常光拍攝圖和熒光圖(a);單轉GFP指征每一孔細胞的轉染效率(b)Fig.3 GFP channel and phase contrast channel were recorded at 48 h after co-transfection(a)and GFP transfection only(b)

3 討 論

從感染機制上來看,HBV感染宿主細胞后,基因組DNA進入細胞核,經(jīng)DNA聚合酶修復缺失部分,形成共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)[11].HBV基因組DNA在復制過程中至少轉錄5種主要的mRNA,其中pregenomic (pg)RNA,長約3.5 kb,由Core Promoter啟動,包含HBV基因組的全部序列,是HBV用作病毒復制的RT模板,并可以翻譯Core和Pol蛋莊,長度約為HBV全基因組的1.1倍.形成正確的pgRNA是HBV DNA重組質粒支持體外HBV復制的必要條件[12-13],所以在體外可復制的HBV DNA重組體至少要包含1.1倍以上的HBV基因組,而由于HBV基因組的特殊結構,構建體外可復制重組體比較困難.

圖4 轉染Huh7細胞后檢測上清的HBsAg水平(a)和HBeAg水平(b)和細胞內(nèi)的顆粒中DNA水平(c)Fig.4 Detection of HBs Ag(a)and HBeAg(b)in supematants 96 h after transfection and the quantity of HBV DNA in cells 96 h after transfection(c)

有效HBV體外感染模型的缺乏,極大地限制了HBV的研究.據(jù)文獻[14]報道,多數(shù)與HBV相關的體外研究都是通過HBV DNA重組質粒轉染到肝癌細胞系(如HepG2和Huh7細胞)來進行.而現(xiàn)有的HBV體外重組體基本是通過多步復雜的酶切連接過程對標準病毒株進行片段置換而形成,這些方法會受制于HBV高度異質性[15-16],因此通用性較差,而且,酶切方法具有序列依賴性,對酶切位點有嚴格的要求,也會造成通用性差,因此難以用于多樣本的臨床試驗研究.

此外,為了防止PCR過程中HBV序列發(fā)生變異,影響實驗結果,我們應用了高保真性聚合酶PrimeSTAR GXL DNA Polymerase來保證實驗結果的準確可靠.相比于r Taq DNA聚合酶,具有高保真性、適合于“熱啟動”PCR、可用于高GC含量模板等優(yōu)點,它還配有最佳的緩沖液,對多種的目標物都可進行長鏈PCR.但是此高保真性聚合酶也有缺點,即其PCR產(chǎn)物為平末端,需要另外加A尾才能進行T克隆的連接,但是本文用的Gibson Assembly的方法避免了T克隆連接這一步,所以用此高保直性聚合酶非常合適.

從本實驗的結果也可以看出4份HBs Ag陽性的標本,都能有HBeAg的表達,但是HBsAg與HBeAg沒有呈現(xiàn)出明顯的相關性.在臨床中,不同的病人中HBs Ag和HBe Ag是有差異的,因為不同病人體內(nèi)感染的HBV的復制表達能力并不相同,同時一些常見突變,例如HBs Ag MHR區(qū)突變,前C區(qū)/C區(qū)基本核心啟動子突變等可以顯著影響HBs Ag和HBe Ag的分泌.血清中HBsAg與HBeAg的水平有一定的相關性,在臨床病例中,一般HBe Ag陽性的病人HBs Ag定量水平相對HBe Ag陰性的病人普遍較高,但HBeAg的定量水平目前由于缺乏臨床意義而極少研究,另外由于HBs Ag和HBe Ag由HBV基因組不同的ORF分別編碼,所以二者并不是絕對的相關.

4 結 論

本研究從HBV感染者血清中直接提取DNA作為模板,應用分子生物學新技術Gibson Assembly的方法快速構建HBV全基因組1.1倍體,能夠盡量避免復雜的酶切和連接過程,并且得到的HBV DNA序列完全來自臨床樣本病毒株基因組,能夠支持HBV體外復制.僅需3個步驟就可以將臨床血中的基因組構建為1.1倍基因組克隆,周期僅僅只有2 d.我們采取的這種新型的基于Gibson Assembly的1.1倍基因組克隆構建方法,獲得的產(chǎn)物效率高、操作簡便、實驗周期短,可以作為一種簡單快速的方法驗證分析臨床調(diào)取的HBV表型,例如復制能力和病毒抗原表達水平.

[1] Dienstag J L.Hepatitis B virus infection[J].The New England Journal of Medicine,2008,359:1486-1500.

[2] Organization WHO.Hepatitis B[EB/OL].[2014-07-26] http:∥who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/.

[3] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.我國控制乙肝成效顯著[EB/OL].(2013-07-26)[2014-07-26]http:∥www.nhfpc.gov.cn/jkj/s3582/201307/518216575e544 109b2caca07fca3b430.shtml.

[4] 欽倫秀,孫惠川,湯釗猷.原發(fā)性肝癌研究進展——2006滬港國際肝病大會紀要[J].中華外科雜志,2006,44 (15):1070-1074.

[5] 肖開銀,彭民浩.原發(fā)性肝癌流行病學研究進展[J].中國普外基礎與臨床雜志,2000,7(4):272-274.

[6] Nassal M,Schaller H.Hepatitis B virus replication[J]. Trends in Microbiology,1993,1:221-228.

[7] Durantel D,Carrouee-Durantel S,Werle-Lapostolle B,et al.A new strategy for studying in vitro the drug susceptibility of clinical isolates of human hepatitis B virus[J]. Hepatology,2004,40(4):855-864.

[8] Gibson D G,Young L,Chuang R Y,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases [J].Nature Methods,2009,6(5):343-345.

[9] Guo H,Jiang D,Zhou T,et al.Characterization of the intracellular deproteinized relaxed circular DNA of hepatitis B virus:an intermediate of covalently closed circular DNA formation[J].Journal of Virology,2007,81:12472-12484.

[10] Yuan Q,Ou S H,Chen C R,et al.Molecular characteristics of occult hepatitis B virus from blood donors in southeast China[J].Journal of Clinical Microbiology, 2010,48:357-364.

[11] Tang H,Mc Lachlan A.A pregenomic RNA sequence adjacent to DR1 and complementary to epsilon influences hepatitis B virus replication efficiency[J].Virology, 2002,303:199-210.

[12] Pollack J R,Ganem D.An RNA stem-loop structure directs hepatitis B virus genomic RNA encapsidation[J]. Journal of Virology,1993,67:3254-3264.

[13] Wang G H,Zoulim F,Leber E H,et al.Role of RNA in enzymatic activity of the reverse transcriptase of hepatitis B viruses[J].Journal of Virology,1994,68: 8437-8442.

[14] Durantel D,Brunelle M N,Gros E,et al.Resistance of human hepatitis B virus to reverse transcriptase inhibitors:from genotypic to phenotypic testing[J].Journal of Clinical Virology:the Official Publication of the Pan A-merican Society for Clinical Virology,2005,34(Sup 1): S34-S43.

[15] Medley G F,Lindop N A,Edmunds W J,et al.Hepatitis-B virus endemicity:heterogeneity,catastrophic dynamics and control[J].Nature Medicine,2001,7:619-624.

[16] de Maddalena C,Giambelli C,Tanzi E,et al.High level of genetic heterogeneity in S and P genes of genotype D hepatitis B virus[J].Virology,2007,365:113-124.

Using Gibson Assembly to Construct Replication-competent 1.1 Copies of Hepatitis B Virus Genome

FANG Lin-lin,SONG Liu-wei,YANG Lin,WU Yong,YUAN Quan*,XIA Ning-shao
(National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases, School of Public Health,Xiamen University,Xiamen 361101,China)

:Hepatitis B virus(HBV)has a highly compact genetic organization,that is why the replication-competent genome which can fulfill the entire HBV lifecycle in vitro is arranged as an over 100%head to tail DNA genome,at least 1.1 copies of HBV genome.There always concludes several times of restriction enzyme digestion and connection in the traditional construction methods, leading to the steps of previous methods are cumbersome and time consuming.In this report,we develop a novel strategy based on Gibson Assembly and result in a fast and convenient method which just needs one step to complete the construction after HBV DNA obtained.In this method,we successfully constructed 4 1.1-fold-overlength genome plasmids directly extracted from serum specimens and confirmed the plasmid is replication-competent by transfecting in Huh7 cells.This new strategy simplifies the construction procedures and results in a fast and high-efficiency method that is especially suitable to be applied in clinical samples.

hepatitis B virus;Gibson Assembly;1.1 copies

R 373.2+1,Q 785

A

0438-0479(2015)03-0324-07

10.6043/j.issn.0438-0479.2015.03.005

2014-07-26 錄用日期:2015-01-04

*通信作者:yuanquan@xmu.edu.cn

方琳琳,宋瀏偉,楊林,等.利用Gibson Assembly技術構建乙型肝炎病毒1.1倍體復制子[J].廈門大學學報:自然科學版,2015,54(3):324-330.

:Fang Linlin,Song Liuwei,Yang Lin,et al.Using Gibson Assembly to construct replication-competent 1.1 copies of hepatitis B virus genome[J].Journal of Xiamen University:Natural Science,2015,54(3):324-330.(in Chinese)