雒曉芳，汪如婷，田丹妮，莫芳芳，馬麟龍

(1.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730100；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730100)

銅綠假單胞菌對萘菲的降解研究

雒曉芳1，汪如婷2，田丹妮2，莫芳芳2，馬麟龍2

(1.西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅蘭州730100；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730100)

文章以萘、菲為惟一碳源，研究了銅綠假單胞菌對萘、菲的降解特性試驗(yàn).結(jié)果表明，銅綠假單胞菌能以萘、菲為惟一碳源，對萘、菲具有較好的降解能力.21天菲與萘的最高降解率分別可達(dá)95.1%和92.3%.此菌株對菲、萘的脫氫酶活性有一定的影響，0～10天其脫氫酶活性迅速增強(qiáng)，10天達(dá)到最高值，隨后逐漸下降.從微生物數(shù)量可知，不同濃度的萘、菲對微生物的生長也有較大的影響.濃度過低時，菌體生長緩慢；濃度過高，銅綠假單胞菌本身產(chǎn)生的副作用會抑制微生物的生長.

銅綠假單胞菌;萘;菲;降解能力

多環(huán)芳香烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,簡稱PAHs)是最早被認(rèn)識的致癌化合物，分子結(jié)構(gòu)中一般具有兩個或兩個以上苯環(huán)結(jié)構(gòu)的烴類化合物.它一般是無色，或淺黃綠色的固體結(jié)晶.多環(huán)性芳香化合物在一些石油開采區(qū)、煤廠開采區(qū)、垃圾的焚燒處理廠，一些碳?xì)浠衔锏牟煌耆紵a(chǎn)生.多環(huán)芳香烴類物質(zhì)在自然界中能夠維持相對的穩(wěn)定狀態(tài)，這主要得益于它能夠自我降解.它降解的方式包括生物降解、氧化、光作用裂解等方式，其中起到主要作用的是生物的降解[1].自然界有著豐富的降解的微生物資源，這些資源能夠維持環(huán)境中的多環(huán)芳香烴類物質(zhì)的動態(tài)平衡，在自然環(huán)境中始終處于較低濃度的水平上.但隨著自然環(huán)境的開發(fā)、經(jīng)濟(jì)迅速的發(fā)展，人類生產(chǎn)活動無休止的開發(fā)與索取原料，破壞了環(huán)境的生態(tài)平衡，使得自然界中多環(huán)芳香烴類物質(zhì)含量的相對平衡被破壞.多環(huán)芳香烴在一些石油，天然氣及防腐劑生產(chǎn)區(qū)的土壤中廣泛存在.土壤是多環(huán)芳香烴類在環(huán)境中累積和遷移的重要載體之一[2].由于多環(huán)芳香烴具有低水溶性和高辛醇-水分配系數(shù)，因而易被吸附到土壤顆粒上，并在糧食與蔬菜等作物體內(nèi)富集，并通過食物鏈威脅著人類的健康，因而對多環(huán)芳香烴的認(rèn)識、處理、掌握及其降解的機(jī)理等是至關(guān)重要的[3-4].萘與菲都是平面型分子，分子中的三個苯環(huán)都在同一個平面上，菲的一元取代物異構(gòu)體比萘的多，菲一共有五種一元異構(gòu)體.菲的芳香性比萘差，因而它比萘更容易反應(yīng).菲在結(jié)構(gòu)上有一個灣區(qū)和一個K區(qū)，這兩個結(jié)構(gòu)可能是與PAHs的致癌有關(guān).同時菲的這種結(jié)構(gòu)對研究PAHs降解氧化酶的立體選擇性至關(guān)重要，因此菲成為了PAHs研究的模式化合物.又因菲在環(huán)境和生物體內(nèi)檢出率非常高，所以菲成為了PAHs的代表物之一.目前對于降解多環(huán)芳香烴類化合物的途徑有許多種，但是相對來說,比較有效、環(huán)保、不產(chǎn)生二次污染的方法當(dāng)屬于微生物降解了[5].

本實(shí)驗(yàn)通過從甘肅隴東油田第27號油井附近土壤樣品中分離純化所得的銅綠假單胞桿菌,研究其對萘菲的降解特性,以便為多環(huán)芳香烴類污染的生物修復(fù)提供相應(yīng)的理論依據(jù)和治理措施，對降低或消除多環(huán)芳香烴類化合物的污染，成功實(shí)現(xiàn)多環(huán)芳香烴類的生物修復(fù)具有重要的意義[6].

1 材料與方法

1.1 菌種來源

本實(shí)驗(yàn)所用的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，簡稱PA，是由西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心微生物實(shí)驗(yàn)室分離純化所得.

1.2 主要試劑

萘、菲、正己烷、活性炭、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、無機(jī)鹽培養(yǎng)基等.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 銅綠假單胞菌(PA)對萘、菲的降解

將菌種在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h得到種子液，之后4 000 r/min離心3 min，棄上清.將菌體用滅菌的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基洗滌3次，最后用無機(jī)鹽培養(yǎng)基制成菌懸液.以上操作保持無菌條件.于每個50 mL三角瓶中加入15 g活性炭，按不同的濃度(3%、5%、7%、10%)加入萘或菲的正己烷溶液，在超凈臺中放置，待正己烷揮發(fā)完全后，加入15 mL菌液，置30 ℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng).設(shè)置5個重復(fù)組，在0 d、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d時，測定其降解率.

1.3.2 微生物數(shù)量測定方法

當(dāng)培養(yǎng)物培養(yǎng)到0 d、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d時，分別稱取樣品1 g，加入到含9 mL無菌水的無菌試管中，混勻后得到稀釋度為10-1的懸濁液，吸取1 mL加入第二個裝有9 mL無菌水的試管中，依次稀釋，保留稀釋度為10-5、10-6、10-7的樣品.用移液槍分別吸取稀釋度為10-5、10-6和10-7的樣品0.1 mL加入預(yù)先倒好培養(yǎng)基的平皿里，用無菌涂布棒涂布均勻.每個稀釋度重復(fù)兩次，涂完后將平皿倒置放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng).48 h后將培養(yǎng)好的平皿置于菌落計(jì)數(shù)儀上統(tǒng)計(jì)菌落數(shù).然后通過公式：微生物數(shù)量(cfu/g)=(平均菌落數(shù)*稀釋倍數(shù))/每個平皿中所加菌的量.

1.3.3 萘、菲標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用正己烷分別準(zhǔn)確配置濃度梯度為0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L、0.04 g/L、0.05 g/L的萘、菲標(biāo)準(zhǔn)溶液，在紫外分光光度計(jì)上分別于268 nm和293 nm波長下測定吸光值，得出萘和菲的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.4 脫氫酶活性的測定

取8支試管，進(jìn)行標(biāo)記，依次加入2 mL Tris-HCl緩沖液和2 mL 蒸餾水.然后按照標(biāo)記加入2 mL 濃度分別為20 ug/mL、40 ug/mL、60 ug/mL、80 ug/mL、100 ug/mL、120 ug/mL、140 ug/mL的TTC系列溶液.對照管不加TTC溶液；再各加入1 g低亞硫酸鈉，振蕩搖勻，待溶液充分顯色后，各管分別加入5 mL甲苯，振蕩萃取2 min，靜置.待溶液分層后，取上層溶液在紫外可見分光光度計(jì)上486 nm處用甲苯作空白測定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2 結(jié)果與分析

2.1 脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為脫氫酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線，脫氫酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.013x-0.0102，相關(guān)系數(shù)R2=0.9939，x表示TTC濃度，y表示在不同濃度的TTC對應(yīng)的吸光度值.

2.2 菲與萘的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2為菲的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=71.52x+0.194，相關(guān)系數(shù)R2=0.985，x表示TTC濃度，y表示在不同濃度的TTC對應(yīng)的吸光度值.圖3為萘的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=48.25x-0.017，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，x表示TTC濃度，y表示在不同濃度的TTC對應(yīng)的吸光度值.

2.3 菲、萘的降解率

以正己烷為空白對照，用紫外分光光度法分別在268 nm和293 nm處測得萘和菲的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算萘、菲的降解率.

圖1 脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 菲的標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖3 萘的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 不同培養(yǎng)天數(shù)菲的降解率 圖5 不同培養(yǎng)天數(shù)萘的降解率

圖4、圖5反映的是3%～10%的萘、菲濃度隨時間的變化，其降油率的變化.從0～21天間，0～5天萘、菲被快速降解，5天后降解速率減慢，尤其是14～21天內(nèi)，萘和菲的降解量很少.估計(jì)可能是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，微生物不斷代謝，細(xì)胞有害的產(chǎn)物積累過多等抑制了對萘與菲的進(jìn)一步降解[7]，加上營養(yǎng)物質(zhì)消耗，酶促反應(yīng)速率減小，使降解速率減緩.

另一方面,萘、菲的濃度對微生物的降解作用有著顯著的影響.由于萘或菲是降解體系中惟一碳源，當(dāng)濃度過低時會影響微生物的生長，也不利于降解的進(jìn)行；而當(dāng)濃度過高時，微生物的生長會受到抑制[8].菲與萘的降解率都隨著濃度的增加而降低，銅綠假單胞菌對3%的菲與萘降解效果最好，但是兩者的降解率也有所不同，菲的芳香性因?yàn)楸容恋牟?，所以它比萘更容易反?yīng).經(jīng)過21 d，菲與萘的降解率達(dá)到95.1%，92.3%.

2.4 脫氫酶活性的測定

在0 d、3 d、7 d、10 d、14 d、21 d時取樣測其脫氫酶活性.將測得的吸光度值代入式：y=0.013x-0.0102，求得脫氫酶活的值.

圖6 菲脫氫酶活性 圖7 萘脫氫酶活性

由圖6、圖7可知，銅綠假單胞菌株對菲與萘的脫氫酶活性有一定的影響，0～10天其脫氫酶活性迅速增強(qiáng)，10天時達(dá)到最高值，隨后逐漸下降. 從圖6、圖7可知，3%的菲脫氫酶活性最佳.5%的萘脫氫酶活性最佳；其余濃度均次之.可見，在相同的條件下菲在較低的正己烷溶液中其脫氫酶活性就比萘的要高.通過物理分析也可以證明，菲與萘都是平面型的分子，三個苯環(huán)分子都在一個平面上，菲的一元取代物有五種異構(gòu)體，而萘的只有兩種.還有菲的芳香性比萘的差，因此菲比萘更容易發(fā)生反應(yīng)，所以菲在環(huán)境中的檢出率很高[9]，是典型的PAHs代表物之一.

2.5 微生物數(shù)量的測定

通過微生物數(shù)量(cfu/g)=(平均菌落數(shù)*稀釋倍數(shù))/每個平皿中所加菌的量公式，計(jì)算微生物數(shù)量，結(jié)果如圖8、9所示.

圖8 菲微生物數(shù)量 圖9 萘微生物數(shù)量

由圖8、圖9可知，反應(yīng)體系中菲與萘兩個反應(yīng)體系中的微生物數(shù)量的生長規(guī)律都是先增大后減小的趨勢.0～7天內(nèi)，兩個反應(yīng)體系中微生物數(shù)量相對來說增長緩慢，待菌株適應(yīng)新的生長環(huán)境后，開始加速生長，培養(yǎng)到第10天時，微生物數(shù)量達(dá)到最大，而后由于微生物的生長達(dá)到一定的值，這樣利用的碳源和養(yǎng)分不斷消耗，加上代謝產(chǎn)物的積累對微生物的抑制作用，銅綠假單胞菌的生長開始進(jìn)入衰退期.萘、菲的濃度對微生物的生長有較大的影響，濃度過低時，由于碳源不足，菌體生長緩慢[10].而濃度過高，一切生命體其本身所需的物質(zhì)都是有一定的量，但達(dá)到它的極限后反而起到抑制作用.因此，碳源過高對于銅綠假單胞菌本身產(chǎn)生的副作用會抑制微生物的生長[11].因此銅綠假單胞菌的菌體生長量隨著萘、菲濃度的升高反而降低.

3 結(jié)論

通過研究銅綠假單胞桿菌對萘菲的降解特性實(shí)驗(yàn)可知,銅綠假單胞菌均能以萘與菲為惟一碳源生長，對萘、菲有較好的降解能力，21 d對菲與萘的降解率最高可達(dá)95.1%和92.3%.其次，銅綠假單胞菌株對菲與萘的脫氫酶活性有一定的影響， 0～10天其脫氫酶活性迅速增強(qiáng)，10天達(dá)到最高值，隨后逐漸下降.萘、菲的濃度對微生物的生長也有較大的影響，濃度過低時，菌體生長緩慢；濃度過高時，銅綠假單胞菌本身產(chǎn)生的副作用會抑制微生物的生長.

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Research on the Features for Naphthalene and Phenanthrene Degradation by Pseudomonas aeruginosa

LUO Xiao-fang1, WANG Ru-ting2,TIAN Dan-ning2,MO Fang-fang2,MA Ling-long2

(1.Center of Experiment, Northwest University for Nationality, Lanzhou 730030, China；2. of Life Science and Engineering College, Northwest University for Nationality, Lanzhou 730030, China)

The researches on the pseudomonas aeruginosa degradation of the naphthalene and phenanthrene were performed in different concentrations under the sole carbon resource of the naphthalene and phenanthrene. The results showed that the pseudomonas aeruginosa can grow under this condition and degraded fully naphthalene and the phenanthrene. The maximum rates of degradation for naphthalene and the phenanthrene reached 95.1% and 92.3% at 21 days, respectively. Additionally，pseudomonas aeruginosa could influence the dehydrogenase activity to a certain extent. The dehydrogenase activity increased rapidly from 0 to 10 day, and reached the peak values at day 10. Then it decreased gradually. According to the bacteria numbers, the different concentrations of naphthalene and phenanthrene had obvious impacts on the growth of microorganism. Enough high concentration of pseudomonas aeruginosahad would inhibit bacteria growth owing to its side effects.

Pseudomonas aeruginosa；Naphthalene；Phenanthrene；Abilities of degradation

2015-05-20

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1308RJZA187)；2014年甘肅省教育廳項(xiàng)目(2014B-010);西北民族大學(xué)2015年本科生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(URIP15166).

雒曉芳(1980—)，女，寧夏涇源人，副教授，碩士,主要從事環(huán)境微生物學(xué)方面的研究.

TQ423

A

1009-2102(2015)02-0025-05