劉艷華 呂狄亞 宋志勇 鄭濱興， 張倩倩， 陸峰 許激揚(yáng)

1 (中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院南京210009)

2(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海200082)

3(太原理工大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，太原030024)

1 引言

丁酸氯維地平(Clevidipine butyrate，CLE)，其化學(xué)名為4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二甲酸甲基(1－丁酰氧基)甲酯(圖1)，是由英國(guó)AstraZeneca 公司研制開發(fā)的一種新型的靜脈注射用抗高血壓藥物，于2008 年8 月經(jīng)美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市［1］，主要用于急性高血壓的治療及術(shù)后血壓的控制［2］。

丁酸氯維地平是一種超短效二氫吡啶類鈣離子通道拮抗劑，可選擇性抑制動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流［3］，其起效迅速，劑量響應(yīng)呈線性，半衰期短(1 ～2 min)，作用結(jié)束也迅速，因此可以通過對(duì)劑量的精細(xì)調(diào)節(jié)起到降壓效果，有助于醫(yī)生在臨床使用中根據(jù)患者的具體血壓監(jiān)測(cè)值采取個(gè)體化用藥，還可以避免一次用藥過量導(dǎo)致過度降壓卻無法糾正的危險(xiǎn)［4］。與硝酸甘油、硝普鈉相比，丁酸氯維地平維持血壓更為有效且更加安全［5，6］。

丁酸氯維地平原料藥在合成及儲(chǔ)存過程中有可能產(chǎn)生反應(yīng)副產(chǎn)物及降解產(chǎn)物，經(jīng)分析及自行合成鑒定，主要有水解雜質(zhì)(以下簡(jiǎn)稱為雜質(zhì)1):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸單甲酯;雙腈雜質(zhì)(雜質(zhì)2):二氰基乙基－4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸酯;重排雜質(zhì)1(雜質(zhì)3):6－(2，3－二氯苯基)－2－甲基－4－氧代環(huán)己烯－2－甲酸甲酯;脫羧氧化雜質(zhì)(雜質(zhì)4):4－(2，3－二氯苯基)－2，6－二甲基－3－吡啶甲酸甲酯;重排雜質(zhì)2(雜質(zhì)5):6－(2，3－二氯苯基)－4－甲基－2－氧代環(huán)己烯－3－甲酸甲酯;雙甲酯雜質(zhì)(雜質(zhì)6):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸二甲酯;脫羧雜質(zhì)(雜質(zhì)7):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3－吡啶甲酸甲酯;氧化雜質(zhì)(雜質(zhì)8):4－(2，3－二氯苯基)－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸甲基(1－氧代丁氧基)甲基酯;乙酯雜質(zhì)(雜質(zhì)9):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸乙基(1－氧代丁氧基)甲基酯;雙丁酯雜質(zhì)(雜質(zhì)10):4－(2，3－二氯苯基)－1，4－二氫－2，6－二甲基－3，5－吡啶二羧酸雙(1－氧代丁氧基)甲酯，各種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)見圖1。

目前，對(duì)丁酸氯維地平的安全性考察及血/尿樣處理及含量測(cè)定方法的報(bào)道較多［7，8］，主要集中在血藥濃度及生物利用度上，而關(guān)于有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法的報(bào)道并不多見，袁慧雅等［9］僅對(duì)丁酸氯維地平及其中間體(雜質(zhì)1)進(jìn)行了研究，并未對(duì)其它有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析，不能全面分析該藥物的質(zhì)量。本研究建立的RP－HPLC 測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的方法，能夠很好地分離丁酸氯維地平及各個(gè)雜質(zhì)，且方法準(zhǔn)確可靠，耐用性良好，可簡(jiǎn)便、快速地測(cè)定丁酸氯維地平中的10 種有關(guān)物質(zhì)。

圖1 丁酸氯維地平(CB)及各雜質(zhì)(IMP)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of clevidipine butyrate (CB)and impurities (IMP)

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)配DAD 檢測(cè)器;電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);pH 計(jì)(丹佛儀器有限公司);KQ－250E 型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司);渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、雜質(zhì)4、雜質(zhì)6、雜質(zhì)7、雜質(zhì)8、雜質(zhì)9、雜質(zhì)10 均為自制，雜質(zhì)3 和雜質(zhì)5 為深圳市倍素特科技有限公司提供，批號(hào)分別為20131226－3、20131226－5;經(jīng)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院鑒定，雜質(zhì)1 ～10 純度分別為97.61%，94.34%，85.05%，99.17%，98.48%，99.56%，90.54%，99.25%，98.48%和98.61%;丁酸氯維地平對(duì)照品為自制，純度為99.81%;各自制雜質(zhì)對(duì)照品及丁酸氯維地平對(duì)照品均按規(guī)定標(biāo)化。

無水NaH2PO4、H3PO4(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為超純水;乙腈、甲醇(HPLC 級(jí)，Merck 公司)。

2.2 溶液配制

2.2.1 系統(tǒng)適用性溶液 準(zhǔn)確稱取各雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，加50%乙腈溶解并定容，搖勻，配制成2000 mg/L單標(biāo)儲(chǔ)備液;準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5 mL 混合于10 mL 量瓶中，50%乙腈定容，配制成100 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。另準(zhǔn)確稱取丁酸氯維地平對(duì)照品40 mg，置10 mL 量瓶中，加入0.4 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入50%乙腈溶解并定容，即得每1 mL 含丁酸氯維地平對(duì)照品4.0 mg，各雜質(zhì)4.0 μg 的適用性溶液。

2.2.2 供試品溶液 準(zhǔn)確稱取本品適量，加50%乙腈溶解并定容，配制成每1 mL 含丁酸氯維地平4.0 mg 的供試品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液 準(zhǔn)確稱取適量丁酸氯維地平對(duì)照品，用50%乙腈溶解并定容，配制200 mg/L 對(duì)照品儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液1 mL 于10 mL 容量瓶中，用50%乙腈定容，制成20.0 mg/L 對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

Symmetry C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);進(jìn)樣體積:20 μL;柱溫:35 ℃;流動(dòng)相A 為0.05 mol/L NaH2PO4(用H3PO4調(diào)至pH 2.5)，B 為乙腈－甲醇(3∶2，V/V)，梯度洗脫:0.0 ～14.0 min，50% ～60% B;14.0 ～42.0 min，60% B;42.0 ～44.0 min，60% ～70% B;44.0 ～63.0 min，70% B;63.0 ～65.0 min，70% ～50% B。檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;流速:1.5 mL/min。

2.4 強(qiáng)制破壞處理

分別取本品40 mg 于10 mL 容量瓶中，經(jīng)高溫、光照、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和氧化破壞。各破壞條件如下:(1)高溫破壞:120 ℃保溫24 h;(2)光照破壞:(4500 ±500)lx 光照20 d;(3)強(qiáng)酸破壞:加入1 mL 2 mol/L HCl，70 ℃保溫4 h;(4)強(qiáng)堿破壞:加入1 mL 1 mol/L NaOH，室溫放置1 h;(5)氧化破壞:加入30%(w/w)H2O21 mL，70 ℃保溫4 h。將破壞后樣品加50%乙腈溶解并定容(酸、堿破壞樣品需先分別中和)，即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 雜質(zhì)來源解析

根據(jù)丁酸氯維地平合成路線及其破壞性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)各雜質(zhì)的來源進(jìn)行分析，見圖2。

圖2 各雜質(zhì)降解途徑解析Fig.2 Showing potential impurities arising from side reaction and degradating

3.2 高效液相色譜條件的優(yōu)化

本研究系統(tǒng)地優(yōu)化了檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱、流動(dòng)相、流速及柱溫等參數(shù)，結(jié)果見表1。對(duì)丁酸氯維地平及其10 種雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)了有效分離(各雜質(zhì)間分離度≥1.5;雜質(zhì)與主峰間分離度≥2.0)，并對(duì)本方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，為丁酸氯維地平原料藥的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定提供了較為便捷的分析方法。

3.2.1 紫外波長(zhǎng)的考察 由各物質(zhì)的紫外吸收特性可知，雜質(zhì)4、雜質(zhì)7、雜質(zhì)8 僅在末端有吸收，考慮基線穩(wěn)定，選用220 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)，在此檢測(cè)波長(zhǎng)下，主成分及其它雜質(zhì)也有良好吸收。

3.2.2 色譜柱的考察 分別考察了LP－C18柱(250 mm ×3.0 mm，5 μm)、Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent SB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、XDB－C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)及ODS－2 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)對(duì)適用性溶液中各物質(zhì)峰之間分離度的影響，結(jié)果表明，Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)能夠很好地滿足分離要求。

表1 方法優(yōu)化結(jié)果Table 1 Results of method optimization

3.2.3 NaH2PO4溶液的濃度及其pH 的考察 使用NaH2PO4溶液作為流動(dòng)相的水相，并對(duì)其濃度(0.02，0.04 和0.05 mol/L)及pH 值(2.0，2.5 和3.0)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，隨著NaH2PO4濃度增加，雜質(zhì)7 與雜質(zhì)8 的分離度增大，且當(dāng)pH=2.5 時(shí)，各成分間的分離度最佳，故選擇0.05 mol/L NaH2PO4溶液(pH 2.5)作為水相。

3.2.4 流速的考察 考察流速為1.1，1.3 和1.5 mL/min 時(shí)，各峰的分離情況。實(shí)驗(yàn)表明，隨著流速增大，雜質(zhì)7 與雜質(zhì)8 及雜質(zhì)8 與主峰之間分離度均有所改善，并考慮到柱壓及色譜柱的耐用性，并沒有繼續(xù)升高流速，最終選擇1.5 mL/min 為最佳流速。

3.2.5 柱溫的考察 在30 ～40 ℃進(jìn)行分析，隨著溫度升高，雜質(zhì)7 與雜質(zhì)8 的分離度增大，而雜質(zhì)8與主峰的分離度減小;結(jié)果表明，在35 ℃時(shí)，分離度良好。

3.2.6 溶劑的考察 選擇流動(dòng)相作為溶劑，丁酸氯維地平及各雜質(zhì)的溶解性較差，供試品溶液在4 ℃放置數(shù)小時(shí)后會(huì)析出固體;選擇乙腈作為溶劑，雜質(zhì)1 和雜質(zhì)2 的色譜峰對(duì)稱性差，對(duì)稱因子約為2.0;選擇50%乙腈作為溶劑，各母液在4 ℃放置數(shù)天均未見析出固體;故最終確定使用50%乙腈作為溶劑。

3.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

3.3.1 雜質(zhì)分離度及空白溶劑實(shí)驗(yàn) 取2.2 節(jié)系統(tǒng)適用性溶液、供試品溶液、對(duì)照品溶液及空白溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按出峰前后，對(duì)雜質(zhì)命名，分別為雜質(zhì)1 ～10，各自保留時(shí)間分別為7.657，8.485，13.962，15.316，16.018，17.527，26.385，28.232，41.299 和48.341 min;丁酸氯地平出峰時(shí)間為29.911 min;各峰之間均能達(dá)到良好分離(各雜質(zhì)峰之間分離度≥1.5，雜質(zhì)8 與主峰分離度≥2.0);空白溶劑對(duì)有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定無干擾(圖3)。

3.3.2 強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn) 將本品經(jīng)高溫、光照、酸、堿和氧化破壞，結(jié)果表明，本品在高溫及光照環(huán)境中較穩(wěn)定，基本無降解;對(duì)堿性環(huán)境極不穩(wěn)定，主要的降解產(chǎn)物為雜質(zhì)1 和雜質(zhì)7。在各降解條件下，丁酸氯維地平與各雜質(zhì)峰及降解產(chǎn)物均能達(dá)到良好分離，方法專屬性良好(圖4)。并且，在強(qiáng)制降解條件下，雜質(zhì)1、雜質(zhì)7、雜質(zhì)8 及雜質(zhì)10 為丁酸氯維地平主要的降解雜質(zhì)，對(duì)以上4 種雜質(zhì)進(jìn)行重點(diǎn)分析。

3.4 線性范圍，檢出限和定量限

稱取各雜質(zhì)及丁酸氯維地平對(duì)照品適量，配制成不同濃度的線性溶液，按2.3 節(jié)操作，測(cè)定并考察各成分的線性關(guān)系及相對(duì)校正因子。以進(jìn)樣濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸曲線分析(表2)。由表2 可知，雜質(zhì)2 與雜質(zhì)9 相對(duì)于主成分的校正因子在0.9 ～1.1 之間，可采用不加校正因子的主成分外標(biāo)法測(cè)定該物質(zhì);對(duì)于其它雜質(zhì)，其校正因子均超出此范圍，因此選用加校正因子的主成分外標(biāo)法進(jìn)行研究［10］。

以信噪比(S/N=10)計(jì)算方法的定量限，以信噪比(S/N=3)計(jì)算方法的檢出限，結(jié)果符合要求(表2)。

圖3 系統(tǒng)適用性溶液(a)、空白溶劑(b)、供試品溶液(c)和對(duì)照品溶液(d)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of system suitability solution (a)，blank solvent (b)，sample solution (c)and reference solution (d)

圖4 高溫(a)、光照(b)、酸(c)、堿(d)、氧化(e)破壞及酸空白(G)、堿空白(H)和氧化空白(I)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of heat (a)，light (b)，acid (c)，alkali (d)，oxidation (e)damage and acid blank (G)，base blank (H)and oxidation blank (I)

表2 線性范圍、回歸方程與校正因子Table 2 Linear range，regression equation and correction factor

3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

平行配制6 份供試品溶液，按限度加入雜質(zhì)1、雜質(zhì)7、雜質(zhì)8 及雜質(zhì)10，按2.3 節(jié)方法檢測(cè)，記錄色譜圖，計(jì)算各雜質(zhì)的RSD 值。雜質(zhì)1、雜質(zhì)7、雜質(zhì)8 及雜質(zhì)10 的重復(fù)性RSD 值分別為0.6%，2.3%，1.3%和1.1% (n=6);結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好(RSD≤10.0%)。

連續(xù)兩天，由兩名操作人員，各平行配制6 份樣品溶液，按限度加入雜質(zhì)1、雜質(zhì)7、雜質(zhì)8 及雜質(zhì)10，按2.3 節(jié)檢測(cè)，記錄色譜圖，并計(jì)算各雜質(zhì)的RSD 值(RSD≤15.0%)。雜質(zhì)1、雜質(zhì)7、雜質(zhì)8 及雜質(zhì)10 的日間精密度RSD 分別為2.6%，2.2%，3.1%，1.4% (n=12);結(jié)果表明，本方法的日間精密度良好。

3.6 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取丁酸氯維地平對(duì)照品溶液及加入限度有關(guān)物質(zhì)的樣品溶液，分別在0，5，10，17，24 h 按2.3 節(jié)測(cè)定，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各測(cè)定2 次。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液峰面積RSD 為1.6% (n=10);雜質(zhì)1、雜質(zhì)7、雜質(zhì)8 及雜質(zhì)10 的峰面積RSD 分別為1.6%，2.7%，1.8%及3.1%(n =10);結(jié)果表明，對(duì)照品溶液及各雜質(zhì)在室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好(RSD≤5.0%)。

3.7 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，制備加標(biāo)濃度分別為限度濃度50%，100%和150%水平的供試品溶液，每個(gè)水平平行制備3 份。計(jì)算所得的回收率應(yīng)為80% ～120%，RSD≤10.0%。結(jié)果表明，雜質(zhì)1 的回收率為98.75% ～103.76%，平均回收率為101.06%，RSD 為0.9%(n =9);雜質(zhì)7 的回收率為96.26% ～108.74%，平均回收率為102.8%，RSD 為4.9% (n =9);雜質(zhì)8 的回收率為94.3% ～106.00% 范圍內(nèi)，平均回收率為99.6%，RSD 為3.3% (n=9);雜質(zhì)10 的回收率在100.5% ～113.3% 范圍內(nèi)，平均回收率為106.6%，RSD 為3.1% (n=9)。結(jié)果表明，本方法的準(zhǔn)確度良好。

3.8 耐用性實(shí)驗(yàn)

分別考察了不同批號(hào)色譜柱、流動(dòng)相配比、流速和柱溫的微小波動(dòng)對(duì)系統(tǒng)適用性溶液中各峰分離度的影響。結(jié)果表明，上述條件微小變化及色譜柱批號(hào)變化后，各物質(zhì)峰之間仍能達(dá)到基線分離，雜質(zhì)峰之間分離度均不小于1.5，雜質(zhì)8 與丁酸氯維地平之間分離度不小于2.0，說明本方法的耐用性良好。

3.9 樣品分析

取3 批供試品，按2.2 節(jié)制備供試品溶液，按2.3 節(jié)測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果(%)Table 3 Determination results of related substances (%)

綜上所述，本研究建立了一種簡(jiǎn)單、快速、有效的RP－HPLC 分析方法，對(duì)丁酸氯維地平進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的分析，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證［11］，結(jié)果表明，本方法能夠使丁酸氯維地平及其10 種雜質(zhì)均達(dá)到良好的基線分離，且方法靈敏度、耐用性均良好，可以很好地適用于測(cè)定丁酸氯維地平中的有關(guān)物質(zhì)。

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