楊芬 賀玖明 張瑞萍 再帕爾·阿不力孜

1(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100050)

2(北京腫瘤醫(yī)院，北京100142)

1 引言

氧自由基與心腦血管、腫瘤及老年性疾病的發(fā)生具有密切關(guān)系［1～4］，抗氧化藥物在臨床、保健、食品等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，尋找高效、低毒的抗氧化劑備受重視。目前，檢測(cè)或評(píng)價(jià)化合物抗氧化活性的常用方法有電子自旋共振法［5～7］、電化學(xué)方法［8］、色譜法［9，10］和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)［11，12］等。這些檢測(cè)方法的共同點(diǎn)是樣品處理時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)及其數(shù)據(jù)處理繁瑣，包括羥自由基(·OH)的產(chǎn)生體系以及化合物捕捉·OH 的反應(yīng)，對(duì)大量樣品的快速檢測(cè)具有一定的局限性。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)化合物抗氧化作用強(qiáng)弱的新型分析方法，對(duì)加快抗氧化藥物的篩選及研發(fā)具有重要意義。

快原子轟擊離子化質(zhì)譜(FAB-MS)方法是一種成熟的質(zhì)譜技術(shù)。大多數(shù)化合物的FAB-MS 譜中主要產(chǎn)生［M+H］+離子，也有一些化合物產(chǎn)生比較強(qiáng)的分子離子M+·。本實(shí)驗(yàn)室前期探索了FAB-MS 譜中M+·的相對(duì)強(qiáng)度與化合物抗氧化作用強(qiáng)弱的相關(guān)性［13］，在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了實(shí)驗(yàn)條件對(duì)M+·相對(duì)強(qiáng)度的影響，建立了篩選或預(yù)測(cè)酚類化合物抗氧化作用強(qiáng)弱的簡(jiǎn)便、靈敏、快速的FAB-MS 檢測(cè)方法，并且與常用藥理活性篩選方法進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證了該方法的可靠性。由于FAB-MS 方法具有樣品量少、無(wú)需復(fù)雜樣品處理、檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)(可直接將樣品溶液與基質(zhì)混合后涂于靶上測(cè)定)，因此本方法的建立將有助于加快抗氧化藥物的研發(fā)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

AutoSpec Ultima-Tof 串聯(lián)質(zhì)譜儀(英國(guó)Micromass 公司);FAB 源，Cs+離子槍，加速電壓8000 V，分辨率調(diào)節(jié)為1000。

甲醇(分析純，北京化工廠);FAB-MS 譜測(cè)定使用的基質(zhì):甘油(G，分析純，北京化工廠);間硝基芐醇(m-NBA，色譜純，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司);硫代甘油(TG)、二硫代蘇糖醇/硫代甘油(DTT/TG 12)和1，2 二巰基甘油(BAL)均為色譜純(日本Tokyo Kasei Kogyo 公司)。

黃酮類化合物、酚類化合物以及木脂素類化合物(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1。

表1 選用的黃酮類化合物及其結(jié)構(gòu)Table 1 Structure of flavonoids

2.2 I(M+·)/I(［M+H］+)比值的計(jì)算

I(M+·)/I(［M+H］+)值表示M+·與［M +H］+離子的相對(duì)強(qiáng)度比值，扣除M+·峰13C 同位素對(duì)［M+H］+峰的貢獻(xiàn)后，獲得二者的相對(duì)峰強(qiáng)度比值。

基質(zhì)為間硝基芐醇(m-NBA)，樣品用甲醇溶解。I(M+·)/I(［M +H］+)值均采用10 ～20 次掃描時(shí)間的平均結(jié)果。采用硫代巴比妥酸法(TBA)檢測(cè)化合物對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化(LPO)的抑制率(IR)。

其中，AS和A0分別表示樣品溶液和空白對(duì)照液的吸光度值。

3 結(jié)果與討論

3.1 基質(zhì)對(duì)I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響

選擇合適的基質(zhì)進(jìn)行FAB-MS 譜測(cè)定是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究選擇5 種酚類和黃酮類化合物，系統(tǒng)考察了基質(zhì)對(duì)其I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響。由表2 可見(jiàn)，對(duì)于同一化合物，使用不同基質(zhì)得到的I(M+·)/I(［M+H］+)值不同，m-NBA 最有利于M+·離子的形成。由表3 可見(jiàn)，不同化合物使用相同基質(zhì)得到的I(M+·)/I(［M+H］+)值大小順序保持不變。因此，該值大小雖然與基質(zhì)種類有關(guān)，但主要決定于化合物自身生成M+·和［M +H］+離子的競(jìng)爭(zhēng)能力;同時(shí)說(shuō)明采用相同基質(zhì)比較不同化合物的I(M+·)/I(［M+H］+)值具有可行性。

表2 5 種不同基質(zhì)條件下獲得的3 個(gè)酚類化合物的I(M +·)/I(［M+H］+)值Table 2 I(M +·)/I(［M+H］+)values of three phenolic compounds with five different matrices

3.2 轟擊時(shí)間對(duì)I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響

通常，F(xiàn)AB 條件下的離子化過(guò)程在空間上可分為凝聚相區(qū)、界面區(qū)、氣密層區(qū)和高真空區(qū)4 個(gè)區(qū)域。M+·離子和［M+H］+離子都要通過(guò)氣密層區(qū)進(jìn)入高真空區(qū)，進(jìn)而被檢測(cè)分析。因此，氣密層的穩(wěn)定性對(duì)于M+·和［M+H］+離子的產(chǎn)生及其強(qiáng)度比較重要，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察化合物的離子化與轟擊時(shí)間的關(guān)系，尋找形成穩(wěn)定氣密層區(qū)的階段。

表3 3 種不同基質(zhì)條件下獲得的酚類化合物的I(M +·)/I(［M+H］+)值Table 3 I(M +·)/I(［M+H］+)values of some phenolic compounds with three different matrices

圖1 是以m-NBA 為基質(zhì)測(cè)定阿魏酸的FAB-MS譜，m-NBA 的主要離子m/z 154，阿魏酸的M+·離子(m/z 194)和［M+H］+離子(m/z 195)的絕對(duì)強(qiáng)度隨轟擊時(shí)間的變化結(jié)果?？梢钥闯觯|(zhì)相關(guān)離子的強(qiáng)度隨著掃描次數(shù)的增加迅速增強(qiáng)，在大約5 次掃描后達(dá)到一個(gè)比較穩(wěn)定的階段，而掃描25 次以后基質(zhì)的相關(guān)離子峰強(qiáng)度逐漸變小。這一變化趨勢(shì)反映了氣密層區(qū)的形成與消逝過(guò)程，表明5 ～25 次的掃描時(shí)間內(nèi)已形成穩(wěn)定的氣密層區(qū)。在氣密層區(qū)被測(cè)樣品的I(M+·)/I(［M + H］+)值變化不明顯。因此，選擇10 ～20 次掃描結(jié)果作為判斷I(M+·)/I(［M+H］+)值大小的依據(jù)具有較好的可靠性。

圖1 阿魏酸與m-NBA(基質(zhì))的分子離子峰M +·和準(zhǔn)分子離子峰［M+H］+絕度強(qiáng)度與轟擊時(shí)間的相關(guān)關(guān)系Fig.1 Relationship between absolute intensity of M +·，［M+H］+ion of ferulic acid，［M+H］+ion of matrix and scan time with m-NBA used as the matrix

3.3 樣品濃度對(duì)I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響

在FAB-MS 分析的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)樣品濃度在1 ～200 mmol/L 范圍內(nèi)，能得到較理想強(qiáng)度的分子離子和準(zhǔn)分子離子峰。如果濃度太低，F(xiàn)AB-MS 譜給出的均為基質(zhì)離子峰;而濃度太高，樣品的相關(guān)離子峰強(qiáng)度可能出現(xiàn)過(guò)飽和。因此，本實(shí)驗(yàn)以木脂素類化合物為研究對(duì)象，考察了樣品濃度對(duì)I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響。表4 給出了7 個(gè)木脂素類化合物在濃度分別為10 和50 mmol/L 獲得的I(M+·)/I(［M+H］+)值。如表4 所示，此值隨其濃度大小發(fā)生變化，而不同化合物在濃度相同時(shí)，其相對(duì)順序不變，由此可見(jiàn)，隨著樣品濃度的變化，I(M+·)/I(［M+H］+)值將按一定的規(guī)律發(fā)生變化，但不影響其相對(duì)大小順序。因此，對(duì)于同種結(jié)構(gòu)類型的化合物而言，在相同濃度條件下進(jìn)行FAB-MS 譜分析，獲得的I(M+·)/I(［M+H］+)值可以反映化合物的結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)差異。

表4 不同濃度木脂素類化合物以m-NBA 為基質(zhì)時(shí)獲得的I(M +·)/I(［M+H］+)值Table 4 I(M +·)/I(［M+H］+)values of different concentration of lignanoids compounds with m-NBA used as the matrix

3.4 黃酮類化合物I(M+·)/I(［M+H］+)值與其抗氧化活性的相關(guān)性

在FAB 條件下，M+·離子的產(chǎn)生過(guò)程與酚類抗氧化物的抗氧化作用機(jī)制存在一定相關(guān)性，二者都包含電子轉(zhuǎn)移的過(guò)程，而且失去電子的難易程度與M+·離子的相對(duì)強(qiáng)度有關(guān)，并在一定程度上決定了抗氧化作用的強(qiáng)弱。大部分酚類化合物是斷鏈型抗氧化劑，它們通過(guò)清除自由基發(fā)揮其抗氧化作用［14］?？寡趸瘎┡c自由基發(fā)生反應(yīng)生成苯氧自由基，苯氧自由基穩(wěn)定性越好，表明化合物的抗氧化活性越強(qiáng)［14］。有利于增強(qiáng)苯氧自由基穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)因素主要有:酚羥基鄰對(duì)位有O、N、S 等雜原子或斥電子基團(tuán)的取代以及分子內(nèi)氫鍵的形成等。這些因素同樣有利于FAB 條件下M+·離子的產(chǎn)生，這是由于O、N 等雜原子與苯環(huán)形成p-π 共軛，共軛效應(yīng)使單電子離域程度增大，則有利于形成M+·離子。因此，有利于提高苯氧自由基穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)因素，既能增強(qiáng)酚類化合物的抗氧化活性，也同樣有利于M+·離子的產(chǎn)生，從而使I(M+·)/I(［M +H］+)值增大。因此對(duì)于同種結(jié)構(gòu)類型的酚類化合物，其FABMS 譜中若出現(xiàn)比較強(qiáng)的M+·離子，則該化合物可能具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且抗氧化作用強(qiáng)弱與I(M+·)/I(［M+H］+)值大小具有一定的相關(guān)性。

3.5 黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)類型與I(M+·)/I(［M+H］+)值

黃酮類化合物的抗氧化活性是眾所周知的，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征又可分為黃酮醇、黃酮、異黃酮等不同類型結(jié)構(gòu)。本研究選擇了3 種黃酮類化合物進(jìn)行了系統(tǒng)考察與比較分析。其中，Ⅰ-1 ～Ⅰ-5 屬于黃酮醇類化合物，結(jié)構(gòu)區(qū)別主要在于B 環(huán)羥基數(shù)目和位置。I(M+·)/I(［M +H］+)值分別為0.81，0.79，0.76 和0.7，差異不大，可能原因分析如下:①?gòu)慕Y(jié)構(gòu)因素考慮，B 環(huán)與A、C 環(huán)平面幾乎處于垂直的位置，且B 環(huán)與C 環(huán)之間C1’-C2 鍵的鍵級(jí)為0.992，說(shuō)明B 環(huán)與C 環(huán)的共軛程度很低［15］，故B 環(huán)羥基數(shù)目和位置的變化對(duì)共軛體系電子云密度的影響較小;②羥基的給電子能力能夠降低化合物的電離能，同時(shí)又易與基質(zhì)形成氫鍵，又增加其質(zhì)子親和力，綜合因素的影響結(jié)果造成其I(M+·)/I(［M +H］+)值的變化不大。另外，與其它化合物相比，Ⅰ-1 在B 環(huán)的3’-位上增加了甲氧基，更有利于M+·離子的產(chǎn)生，因此Ⅰ-1 的I(M+·)/I(［M+H］+)值大于其它同類化合物。

Ⅰ-6 ～Ⅰ-10 屬于黃酮類化合物，其中，Ⅰ-6 和Ⅰ-7 的I(M+·)/I(［M +H］+)值分別為0.82 和0.63，二者結(jié)構(gòu)區(qū)別主要在于A 環(huán)取代基。由于A 和C 環(huán)共軛程度較高，取代基對(duì)共軛體系電子云密度的影響較大，從而影響M+·離子的強(qiáng)度。前者A 環(huán)有3 個(gè)鄰酚羥基取代，容易形成分子內(nèi)氫鍵，有利于M+·離子的穩(wěn)定，其I(M+·)/I(［M+H］+)值比較大。Ⅰ-8，Ⅰ-9 和Ⅰ-10 的結(jié)構(gòu)區(qū)別為B 環(huán)羥基的數(shù)目不同，但其I(M+·)/I(［M+H］+)值的差異不大，分別為0.49，0.45 和0.45。分析其原因:一方面，B 環(huán)與C 環(huán)的共軛程度低，B 環(huán)取代的變化對(duì)共軛體系電子云密度影響不大;另一方面，羥基的給電子能力能夠降低化合物的電離能，又能增加化合物的質(zhì)子親和力［16］，使其I(M+·)/I(［M+H］+)值變化不大。

Ⅰ-11，Ⅰ-12，Ⅰ-13 屬于異黃酮類化合物，其中，Ⅰ-11，Ⅰ-12 的主要區(qū)別是B 環(huán)羥基數(shù)目不同，其I(M+·)/I(［M+H］+)值差別不大，分別為0.60、0.55，可能原因與上述相同。與Ⅰ-12 相比，Ⅰ-13 的A 環(huán)5-位缺少羥基，而羥基的給電子能力有利于M+·離子的產(chǎn)生;同時(shí)，5-位羥基易與鄰位羰基形成分子內(nèi)氫鍵，并不會(huì)提高其接受質(zhì)子的能力，因此，Ⅰ-12 的相對(duì)較大，而Ⅰ-13 的I(M+·)/I(［M +H］+)值相對(duì)較小(0.35)。

以上結(jié)果及分析解釋了相關(guān)化合物在FAB-MS 譜中獲得的I(M+·)/I(［M +H］+)值的差異，并且從結(jié)構(gòu)因素角度闡述了供電子基的存在將有利于FAB 條件下M+·離子的產(chǎn)生，同時(shí)也能提高酚類抗氧化物產(chǎn)生苯氧自由基的穩(wěn)定性。

3.6 I(M+·)/I(［M+H］+)值與抗氧化活性的相關(guān)性

本實(shí)驗(yàn)將I(M+·)/I(［M+H］+)值與文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮化合物抗氧化活性的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)表5。其中，TEAC(Trolox equivalent antioxidant activity)值表示化合物對(duì)ABTS+·陽(yáng)離子自由基的清除能力［17］，Effect 值(%)表示化合物對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力［18］。

從表5 可知，文獻(xiàn)報(bào)道的兩種方法獲得結(jié)果也不完全一致，但可反映出不同類型黃酮化合物的構(gòu)效關(guān)系。例如，黃酮醇類化合物(Ⅰ-3，Ⅰ-4，Ⅰ-5)的抗氧化能力強(qiáng)于黃酮類(Ⅰ-9)和二氫黃酮類化合物(Ⅰ-14)，而且后兩類化合物的抗氧化活性大小比較接近。FAB-MS 法的結(jié)果表明，化合物I(M+·)/I(［M+H］+)值的大小也反映出了同樣的變化趨勢(shì)，即化合物的I(M+·)/I(［M+H］+)值越大，其抗氧化活性就越強(qiáng)。因此，F(xiàn)AB-MS 方法測(cè)定的I(M+·)/I(［M+H］+)值可以反映酚類化合物的抗氧化作用及其強(qiáng)弱。

3.7 方法驗(yàn)證

為了驗(yàn)證FAB-MS 方法的可靠性，對(duì)12 種酚類化合物進(jìn)行了抗氧化能力的預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)。其中，Ⅱ-1 ～Ⅱ-3 是黃酮類化合物;Ⅱ-4 ～Ⅱ-6 是二苯乙烯類化合物;Ⅱ-7 ～Ⅱ-12 為復(fù)雜多酚化合物。通過(guò)FAB-MS 分析，得到I(M+·)/I(［M+H］+)值，并與其脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力進(jìn)行了比較(TBA 法)，見(jiàn)表6。結(jié)果表明，這些化合物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，這與FAB-MS 法預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，對(duì)于結(jié)構(gòu)相似的化合物而言，I(M+·)/I(［M+H］+)值越大，其抗氧化作用越強(qiáng)。因此，證明FABMS 方法可以用于篩選或預(yù)測(cè)酚類化合物的抗氧化活性。

表5 由FAB-MS 譜獲得的I(M +·)/I(［M+H］+)值與其它方法獲得黃酮類化合物的抗氧化活性強(qiáng)弱的比較Table 5 Comparison of I(M +·)/I(［M +H］+)values obtained from the fast atom bombardment-MS (FAB-MS)spectra of flavonoids and antioxidant activity assayed by other method.

表6 由FAB-MS 譜得到的I(M +·)/I(［M +H］+)值與TBA 法獲得的12 種化合物的抗氧化活性的比較Table 6 Comparison of I(M +·)/I(［M + H］+)values obtained from FAB-MS spectra of 12 phenolic compounds and antioxidant activity assayed by TBA method.

4 結(jié)論

通過(guò)研究黃酮類化合物結(jié)構(gòu)與FAB 譜中得到的I(M+·)/I(［M +H］+)值之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在FAB-MS 譜中有利于產(chǎn)生M+·離子的結(jié)構(gòu)因素同樣有利于酚類抗氧化物清除自由基后產(chǎn)生的苯氧自由基的穩(wěn)定性。采用FAB-MS 方法對(duì)12 個(gè)酚類化合物進(jìn)行了抗氧化能力的預(yù)測(cè)與評(píng)價(jià)，其結(jié)果與TBA 法獲得的基本一致。本研究結(jié)果表明，對(duì)于同種結(jié)構(gòu)類型的酚類化合物，由F AB-MS 法獲得的I(M+·)/I(［M+H］+)值能較好地反映其抗氧化作用的強(qiáng)弱。另外，F(xiàn)AB-MS 方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高及用樣量少等特點(diǎn)，可以作為酚類化合物抗氧化活性的體外篩選或預(yù)測(cè)方法，有助于加速抗氧化藥物的發(fā)現(xiàn)，因此具有良好的應(yīng)用前景。

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