劉德曄 朱峰 馬永建 吉文亮 劉華良

(江蘇省疾病預防控制中心，南京210009)

1 引言

與Pt(Ⅱ)配合物相同，Pd(Ⅱ)配合物也有殺傷腫瘤細胞作用［1～4］，Pt(Ⅱ)和Pd(Ⅱ)性質(zhì)相近，采用dsp2 雜化形成平面四邊形配合物，具有高度相似的結(jié)構(gòu)特征。Pt(Ⅱ)配合物殺傷腫瘤細胞的機理是:其與DNA 中的鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸5′－dGMP 形成分子鍵，使核酸變性細胞死亡［5，6］;同樣，Pd(Ⅱ)配合物也能使核酸變性［7～10］的細胞死亡。核酸由單核苷酸組成，而5′－dGMP 和5′－GMP(鳥嘌呤核糖核苷酸)是核酸的重要組成，研究Pd(Ⅱ)與5′－dGMP 和5′－GMP 發(fā)生分子鍵合原理和方式對Pd(Ⅱ)損傷DNA 以及細胞凋亡機理有理論和現(xiàn)實意義，對開發(fā)Pd(Ⅱ)抗癌藥物有指導作用。Zhu 等［11］用電位滴定法和H1NMR 研究了乙二胺二水合Pd［Pd(en)(H2O)2］2+與鳥嘌呤核苷酸5′－GMP 相互作用，認為在pH 5.0 時［Pd(en)(H2O)2］2+與5′－GMP 的N1 位氮形成化合物［Pd(en)(N1－5′－GMP)(H2O)］;在pH ＞8.0 時，4 分子5′－GMP 上N1 和N7 位氮會與4 分子［Pd(en)(H2O)2］2+形成四元環(huán)狀化合物［Pd(en)(μ－N1，N7－5′－GMP)］4。Zhang 等［12］通過計算確定了［Pd(en)(H2O)2］2+與鳥嘌呤形成的四元環(huán)狀化合物結(jié)構(gòu)。Wirth 等［13］研究了［Pd(en)(H2O)2］2+與5′－GMP 相互作用，認為溶液中除了形成化合物單體和環(huán)狀四聚體外還有二聚體。文獻［11，13］均在混合體系中研究產(chǎn)物組成而未對其進行分離檢測具有一定局限性，且文獻所采用的滴定分析法不能直觀定性，產(chǎn)物具有潛在不確定性。色譜和質(zhì)譜是對復雜體系分離和定性的有力工具，近年來，基于HPLC－ICP－MS 研究食品保健品、水質(zhì)、生物樣本中元素的形態(tài)得到巨大的發(fā)展［14～17］，在鉑類抗癌藥物的研究中得到廣泛應用［18～20］，但未見用于Pd 類抗癌藥物的研究。本研究采用HPLC－ICP－MS 聯(lián)用分離［Pd(en)Cl2］(結(jié)構(gòu)式見圖1b)與5′－dGMP(結(jié)構(gòu)式見圖1a)反應產(chǎn)物，HPLC－DAD 對產(chǎn)物初步定性，并用ESI－MS 得出主產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP反應產(chǎn)物中有兩種能夠在給定色譜條件下流出，且具有相同的紫外吸收光譜，其中主產(chǎn)物經(jīng)ESI－MS(MS/MS)定性為［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］，而另一種產(chǎn)物為它的多聚物，其中［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］可大量存在于堿性體系中。研究還發(fā)現(xiàn)，在反應體系pH 6.0 時，［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP 反應在12 h內(nèi)完成。本研究建立的基于HPLC－ICP－MS 分離乙二胺二氯合Pd［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP 反應產(chǎn)物的方法未見報道，本方法經(jīng)改進，可用于其它Pd(Ⅱ)抗癌藥物的形態(tài)分析。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

ESI－MS 為TSQ QUANTUM ACCESS MAX 串聯(lián)質(zhì)譜儀、X－7 電感耦合等離子體質(zhì)譜及其工作站(美國，Thermal 公司);色譜與ICP－MS 用Peek 管相連，電子觸發(fā)采集數(shù)據(jù);OriginPro 7.0 繪圖軟件;LC－20AB 液相色譜儀(日本島津公司)，配備二極管陣列檢測器(DAD)，色譜柱為Acclaim PA2 C18柱(250 mm×4.6 μm，美國戴安公司)。

99%乙二胺二氯合Pd 和鳥嘌呤脫氧核糖核苷酸二鈉鹽(美國Sigma－Aldrich 公司);Na2HPO4、KH2PO4、HCl、NaOH(分析純，南京化學試劑二廠);娃哈哈純凈水(電阻率大于18 MΩ cm)，1000 mg/L Lu 和Pd 單標溶液(美國Spex 公司);HNO3(德國默克公司)。

圖1 5′－dGMP(a)和［Pd(en)Cl2］(b)的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of 5′－deoxyguanyli acid (5′－dGMP)(a)and［Pd(en)Cl2］(b)

2.2 ［Pd(en)Cl2］與5′-dGMP 反應條件

分別稱取4.7 mg(0.02 mmol)［Pd(en)Cl2］和7.8 mg 5′－dGMP 二鈉鹽(0.021 mmol)，混合，用水溶解并定容至10 mL，其中5′－dGMP 略過量，用磷酸鹽緩沖液和NaOH 分別調(diào)節(jié)至pH 6.0，8.0，9.0 和10.0，在37 ℃水浴中恒溫反應48 h，得到產(chǎn)物的濃溶液，色譜進樣前適當稀釋。

2.3 ICP-MS 和ESI-MS優(yōu)化的工作參數(shù)

本研究選用豐度最高的106Pd(27.33%)作為測定同位素，HPLC－ICP－MS 聯(lián)用時基線離子強度小于50 個計數(shù)。同心霧化器，霧化室為撞球式霧化室，主要參數(shù)經(jīng)優(yōu)化后如表1 所示。

利用ESI－MS(MS/MS)研究含Pd 色譜峰的化學結(jié)構(gòu)，需富集色譜流出物至10 mg/L(以Pd 計)以上有較好的響應，且隨著離子源揮發(fā)氣溫度和毛細管溫度提高信號響應也對應提高，經(jīng)優(yōu)化ESI－MS 的主要參數(shù)為:正離子模式，噴霧電壓3000 V，揮發(fā)氣溫度450 ℃，毛細管溫度400℃，鞘氣12 L/min，輔助氣3 L/min。

2.4 色譜流出物總Pd與進入色譜柱總Pd比例的測定

因沒有Pd(en)－5′－dGMP1 和Pd(en)－5′－dGMP2 標準物質(zhì)，無法通過峰面積積分對反應產(chǎn)物進行定量分析，但可通過收集色譜流出物，然后消解得到流出物中總Pd 含量，并與進樣前總Pd 含量進行對比。

將2.2 節(jié)中的反應液稀釋至含Pd 4.0 mg/L，色譜進樣50 μL，收集保留時間2.0 ～4.0 min 的色譜流出物共1.6 mL，加入1 mL HNO3－HCl(1∶3，V/V)，密封水浴，100 ℃消解30 min 后冷卻，定容至10 mL，ICP－MS測定。ICP－MS 使用10 μg/L Lu 作為在線內(nèi)標。

表1 電感耦合等離子體質(zhì)譜條件Table 1 ICP－MS experimental conditions

3 結(jié)果與討論

3.1 HPLC-ICP-MS及HPLC-DAD條件優(yōu)化

HPLC－ICP－MS 形態(tài)分析中常用的流動相緩沖鹽中碳酸鹽和醋酸鹽可能會導致ICP－MS 錐口積碳，所以不采用;而銨鹽可能會與Pd 鹽絡合，也不采用。因此，流動相用磷酸鹽緩沖液配制，高濃度緩沖溶液可使峰型對稱，但易導致ICP－MS 錐口沉積鹽分。實驗表明，最佳條件為:25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液作為流動相，流速0.8 mL/min。流動相pH 值影響［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP 反應產(chǎn)物的色譜行為，2.2 節(jié)中反應產(chǎn)物(pH 6.0)稀釋后，以HPLC－ICP－MS 研究其在不同流動相中行為，結(jié)果見圖2。

由圖2a 可見，主產(chǎn)物Pd(en)－5′－dGMP1 峰拖尾覆蓋了另一產(chǎn)物Pd(en)－5′－dGMP2，因此純水不適合作為流動相。由圖2b ～2e 可見，隨著流動相pH值增大，主產(chǎn)物Pd(en)－5′－dGMP1 的拖尾現(xiàn)象消失;pH 8.0 時，主產(chǎn)物保留時間為2.8 min，且Pd(en)－5′－dGMP2 保留時間為3.2 min，峰型良好;雖然pH 9.0 時Pd(en)－5′－dGMP2 峰型更好，但堿性過強，柱壓升高，易損壞色譜柱。因此，本實驗選用25 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)作為流動相，［S3］色譜進樣定量環(huán)為50 μL。［Pd(en)Cl2］在此色譜條件下不出峰。

作對應研究的HPLC－DAD 所采用色譜條件與HPLC－ICP－MS 條件相同。DAD 檢測器波長為200 ～350 nm，分辨率1 nm。

3.2 ［Pd(en)Cl2］與5′-dGMP 在不同pH 值下反應產(chǎn)物

按照2.2 節(jié)的方法控制體系pH 6.0，8.0，9.0，10.0，反應48 h 后，將溶液稀釋使總Pd 含量為40 μg/L 進HPLC－ICP－MS 分析，結(jié)果如圖3 所示。同時，將2.2 節(jié)得到的反應液稀釋至含Pd 4.0 mg/L，按照2.4 節(jié)方法測定色譜流出的總Pd 和進樣前樣品的總Pd，得出比值。由圖3 可見，隨著反應體系pH 值的增加，Pd(en)－5′－dGMP1 濃度降低，Pd(en)－5′－dGMP2 在pH 6.0 ～9.0 之間濃度上升，但在pH 10.0 時卻降低，說明Pd(en)－5′－GMP1 易在酸性條件下生成，而Pd(en)－5′－dGMP2 易在堿性條件下生成，與文獻［11，13］的研究結(jié)果不同，［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP在堿性條件下反應產(chǎn)物中始終存在Pd(en)－5′－dGMP1，這是5′－dGMP 比5′－GMP 少一個羥基導致。

圖2 反應稀釋液，以Pd 計含量60 μg/L 的HPLC－ICPMS 圖譜Fig.2 HPLC－ICP－MS chromatogram of reaction diluent(containing 60 μg/L Pd)

由圖3 計算得出，隨著pH 值增大，Pd(en)－5′－dGMP1 與Pd(en)－5′－dGMP2 色譜峰面積之和降低，說明色譜流出的Pd 含量降低。為了定量研究這一過程，用2.4 節(jié)方法以ICP－MS 直接測定色譜流出物總Pd 和進樣前總Pd 含量，得出比值分別96%(pH 6.0)、92% (pH 8.0)、81% (pH 9.0)、43%(pH 10.0)。說明隨著pH 值升高，導致體系生成這兩種產(chǎn)物的比例降低。

3.3 反應體系pH 6.0 Pd(en)-5′-dGMP1生成速度研究

由圖4a 和3.1 節(jié)得出，在pH 6.0 時，［Pd(en)Cl2］與5′－dGMP 反應產(chǎn)物多為Pd(en)－5′－dGMP1，因此，在此條件下研究Pd(en)－5′－dGMP1 的反應速度較易行，通過測定反應時間和Pd(en)－5′－dGMP1 峰高的關(guān)系得出反應完成度(圖4)。由圖4 可見，pH 6.0 條件下反應生成的Pd(en)－5′－dGMP1 在12 h 后即穩(wěn)定。

3.4 Pd(en)-5′-dGMP1 和Pd(en)-5′-dGMP2定性研究

取pH 9.0 的反應液稀釋至總Pd 含量6.0 mg/L，進HPLC－DAD 研究色譜行為和紫外吸收。

圖3 不同pH 值反應稀釋液中的HPLC－ICP－MS 圖譜(以Pd 計含量40 μg/L)Fig.3 HPLC－ICP－MS chromatogram of reaction diluent with different pH value (containing 40 μg/L Pd)

由圖5 可見，Pd(en)－5′－dGMP1 和Pd(en)－5′－dGMP2 紫外吸收光譜相同，說明這兩種物質(zhì)由有高度的相似性，再由圖5a 與圖2c 兩種物質(zhì)峰高比對應說明這兩種產(chǎn)物分子中Pd 百分比相同，進一步印證兩者相似。綜合文獻［11，13］及圖3 和圖5，可推斷Pd(en)－5′－dGMP1 為5′－dGMP 的N1 位氮與［Pd(en)Cl2］按照摩爾比1∶ 1 反應生成的單體［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］，而Pd(en)－5′－dGMP2 為Pd(en)－5′－dGMP1 的多聚物。

Pd(en)－5′－dGMP1 分子用ESI－MS(MS/MS)確定。Pd 有5 個同位素，豐度為104Pd(10.97%)、105Pd(22.23%)、106Pd(27.33%)、108Pd(26.71%)和110Pd(11.81%)。因此，在質(zhì)譜圖中，母離子有特征同位素指紋，如圖6 所示。

圖4 pH 6.0 反應液稀釋后經(jīng)HPLC－ICP－MS 測得的Pd(en)－5′－dGMP1 時間－峰高圖，稀釋液中總 Pd 200 μg/LFig.4 Peak height－time curve of Pd(en)－5′－dGMP1 under reaction pH 6.0，acquired by HPLC－ICP－MS diluent containing 200 μg/L Pd

圖5 pH 9.0 反應稀釋液以Pd 計含量6 mg/L 的HPLC－DAD 圖譜及Pd(en)－5′－dGMP1、Pd(en)－5′－dGMP2 的紫外吸收光譜(a)HPLC 圖譜，(b)t =2.8 min Pd(en)－5′－dGMP1 紫外吸收光譜，(c)t =3.2 min Pd(en)－5′－dGMP2 紫外吸收光譜，(d)t=7.3 min 游離的5′－dGMP 紫外吸收光譜Fig.5 HPLC－DAD study of Pd(en)－5′－dGMP1 and Pd(en)－5′－dGMP2 under reaction pH 9.0，(a)HPLC chromatography，(b)t=2.8 min Pd(en)－5′－dGMP1 UV spectrum，(c)t =3.2 min Pd(en)－5′－dGMP2 UV spectrum，(d)t=7.3 min 5′－dGMP UV spectrum

圖6 中m/z 510，511，512，514 和516 對應Pd(en)－5′－dGMP1 的［M+1］+碎片，質(zhì)譜圖豐度比近似對應Pd 同位素豐度比，說明Pd(en)－5′－dGMP1中只含有1 個Pd 原子，證明該分子是單體，驗證了圖4 的推論。對m/z 511，512，514 進行MS/MS 分析，分別得到m/z(315 和152)、(316 和152)、(318和152)的主要碎片。解析Pd(en)－5′－dGMP1 結(jié)構(gòu)，m/z 315，316，318 ［M +1］+碎片及m/z 152［M +1］+碎片如圖7 所示。

由圖7a 可見，Pd(en)－5′－dGMP1 分子結(jié)構(gòu)為［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］，其中PO3-4的負電荷和Pd原子的正電荷使分子呈電中性，而原與Pd 連接的Cl(或者水解生成的H2O)在質(zhì)譜高能過程中丟失。MS/MS 分析時磷酸脫氧核糖從［Pd(en)(N1－5′－dGMP)］分子上解離得到m/z 315，316 和318 的［M+1］+同位素碎片，同位素碎片進一步解離得到鳥嘌呤。圖7b 和圖7c 兩個碎片印證了圖7a 分子結(jié)構(gòu)的正確性。本實驗嘗試對Pd(en)－5′－dGMP2 進行結(jié)構(gòu)定性，但即使富集到150 mg/L 總Pd，也無明顯質(zhì)譜信號，這可能是由于形成聚合物后所需的離子源揮發(fā)氣溫度和毛細管溫度超出儀器允許范圍。

圖6 Pd(en)－5′－dGMP1 的ESI－MS 質(zhì)譜圖Fig.6 ESI－MS spectrum of Pd(en)－5′－dGMP1

圖7 ESI－MS 得出的Pd(en)－5′－dGMP1 分子結(jié)構(gòu)及其碎片F(xiàn)ig.7 Structure of Pd(en)－5′－dGMP1 and its fragments derived by ESI－MS

1 Puthraya K H，Srivastava T S，Amonkar A J，Chitnis M P.J.Inorg.Biochem.，1985，25:207 －212

2 Tusek－Bozic L，F(xiàn)urlani A，Scarcia V，Clercq E D.J.Inorg.Biochem.，1998，72:201 －210

3 Kuduk－Jaworska J，Puszko A，Kubiak M，Pelczynska M.J.Inorg.Biochem.，2004，98:1447 －1456

4 Hunter T M，Paisey S L，Park H，Cleghorn L，Parkin A，Parsons S，Sadler P J.J.Inorg.Biochem.，2004，98:713 －719

5 Sar D G，Montes－Bayon M，Gonzalez E B，Sierra L M，Aguado L，Comendador M A，Koellensperger G，Hann S，Sanz－Medel A.Anal.Chem.，2009，81(23):9553 －9560

6 Chiavarino B，Crestoni M E，F(xiàn)ornarini S，Scuderi D，Salpin J.J.Am.Chem.Soc.，2013，135:1445 －1455

7 Corduneanu O，Chiorcea－Paquim A，Garnett M，Oliveira－Brett A M.Talanta，2009，77:1843 －1853

8 Vieites M，Smircich P，Pagano M，Otero L，F(xiàn)ischer F L，Terenzi H，Prieto M J，Moreno V，Garat B，Gambino D.J.Inorg.Biochem.，2011，105:1704 －1711

9 Sonmez M，Celebi M，Yardim Y，Senturk Z.Eur.J.Med.Chem.，2010，45:4215 －4220

10 Mukherjee T，Sen B，Zangrando E，Hundal G，Chattopadhyay B，Chattopadhyay P.Inorg.Chim.Acta，2013，406:176 －183

11 Zhu S R，Matilla A，Tercero J M，Vijayaragavan V，Walmsley J A.Inorg.Chim.Acta，2004，357:411 －420

12 Zhang D D，Zhou L X.Comput.Theor.Chem.，2011，967:102 －112

13 Wirth W，Baltronat－Blotevogel，Kleinkes U，Sheldrick W S.Inorg.Chim.Acta，2002，339:14 －26

14 LIU Li－Ping，LV Chao，WANG Ying.Journal of Instrumental Analysis，2010，29(8):767 －771

劉麗萍，呂超，王穎.分析測試學報，2010，29(8):767 －771

15 Nam S H，Oh H J，Min H S，Lee J H.Microchem.J.，2010，95:20 －24

16 JIN Peng－Fei，WU Xue－Jun，ZOU Ding，KUANG Yong－Mei，HU Xin，JIANG Wen－Qing，SUN Chun－Hua.Spectroscopy and Spectral Analysis，2011，31(3):816 －819

金鵬飛，吳學軍，鄒定，鄺詠梅，胡欣，姜文清，孫春華.光譜學與光譜分析，2011，31(3):816 －819

17 Jitaru P，Goenaga－Infante H，Vaslin－Reimann S，F(xiàn)isicaro P.Anal.Chim.Acta，2010，657:100 －107

18 ZHAO Lei－Chao，WANG Meng，ZHENG Ling－Na，GONG Xin，WANG Bing，F(xiàn)ENG Wei－Yue，LIANG Jin－Sheng.Chinese J.Anal Chem.，2012，40(8):1289 －1292

趙磊超，王萌，鄭令娜，宮鋅，汪冰，豐偉悅，梁金生.分析化學，2012，40(8):1289 －1292

19 LIU De－Ye，ZHU Chun，MA Yong－Jian，JI Wen－Liang，LIU Hua－Liang.Chinese Journal of Analysis Laboratory，2012，31(7):75 －79

劉德曄，朱醇，馬永建，吉文亮，劉華良.分析試驗室，2013，31(7):75 －79

20 LIU De－Ye，HAO Yuan－Bin，HAN Wen－Ru，LI Jian，HUO Zong－Li，LIU Hua－Liang.Chinese J.Anal.Chem.，2014，42(11):1667 －1672

劉德曄，郝元斌，韓文儒，李健，霍宗利，劉華良.分析化學，2014，42(11):1667 －1672