王章存，曹 芹，王許東，趙學偉，安廣杰

（1.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000；2.鄭州新威營養(yǎng)技術(shù)有限公司，河南 鄭州 450000）

谷氨酰胺是人體合成蛋白質(zhì)和核苷酸的重要原料，它具有促進淋巴細胞的增殖、增強人體免疫功能、提高機體的抗氧化能力、促進大腦發(fā)育、提高機體耐力、抗疲勞、抗衰老等一系列生理功能[1-2]，已被用于藥品和保健食品[3]。近年來的研究表明，以肽形式存在的結(jié)合態(tài)谷氨酰胺比游離谷氨酰胺的作用效果更明顯[4-5]。因此，以蛋白質(zhì)為原料通過酶解法制備含谷氨酰胺活性肽的研究受到人們的高度重視[6-9]。

小麥蛋白中的谷氨酰胺含量高達35%以上，是目前已知含谷氨酰胺最多的蛋白質(zhì)[10]。以小麥蛋白為原料通過蛋白酶水解可以獲得含有結(jié)合態(tài)谷氨酰胺的活性肽，它具有原料豐富、價格較低等優(yōu)勢。但目前小麥蛋白酶解研究多以酶解產(chǎn)物的溶解性、水解度或小肽含量等單一指標來優(yōu)化酶解條件，而不同處理條件下的酶解產(chǎn)物組分變化與其抗氧化活性之間的關聯(lián)性研究卻少見報道[11-12]。

該文在初步比較幾種蛋白酶對小麥蛋白水解效率的基礎上，進一步研究酶解進程中小麥蛋白的分子組分變化及其清除超氧陰離子的活性，為制備具有較高抗氧化活性的谷氨酰胺活性肽提供必要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥蛋白（又名谷朊粉）：河南蓮花味精公司；堿性蛋白酶2.4 L、復合蛋白酶、中性蛋白酶：Novozymes公司；木瓜蛋白酶：東恒華道公司；蛋白質(zhì)/肽標準品及其分子質(zhì)量分別為：細胞色素C（12 500 u），抑肽酶（6 500 u），桿菌酶（1 450 u），乙氨酰-乙氨酰-酪氨酰-精氨酸（451 u）和乙氨酰-乙氨酰-乙氨酸（189 u）：鄭州利研儀器設備公司。

1.2 儀器與設備

UV8100B紫外可見分光光度計：Lab-Tech公司；600型高效液相色譜儀、2487紫外檢測器、M32工作站：美國Waters公司；TSK gel G2000 SWXL（7.8 mm×300 mm）凝膠色譜柱：日本TOSOH公司；LD5-2A型離心機：北京醫(yī)用離心機廠；SHZ-88A型往復水浴恒溫振蕩器：太倉市實驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 不同蛋白酶水解小麥蛋白效率的比較

在每個酶反應器中加入蒸餾水，將樣品小麥蛋白按20 mg/mL添加量分散其中，分別調(diào)整溫度和pH值，使之分別適應堿性蛋白酶（55℃，pH 8.5）、復合蛋白酶（50℃，pH 7.0）、中性蛋白酶（50℃，pH 7.0）和木瓜蛋白酶（60℃，pH 6.5）反應條件，然后，按酶活為500U/g加入上述4種蛋白酶，反應2 h后，于沸水浴中滅酶10 min后測定水解度（degree of hydrolysis，DH）。

1.3.2 小麥蛋白的酶解

在酶反應器中將小麥蛋白分散到蒸餾水中（使其質(zhì)量濃度為20 mg/mL），加熱到50℃，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值為7.0后加入蛋白酶（500 U/g），然后于第0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h取出酶解物，沸水浴滅酶后用于指標分析。

1.3.3 水解度測定[13]

采用GB 18186—2000《釀造醬油》中的方法測定氨基酸態(tài)氮含量，它與樣品總氮含量比值（%）即為水解度（DH）。

式中：N1為樣品中氨基酸態(tài)氮含量，mg；N2為樣品總氮含量，mg。

1.3.4 可溶性氮含量測定

將酶解后樣品放入帶蓋離心管中，在2 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心10 min，把上清液轉(zhuǎn)移到凱氏消化管中，加入濃硫酸消化后，按照凱氏定氮方法[14]測定氮含量，它與所取樣品中總氮含量比值即為水可溶性氮含量（nitrogen soluble index，NSI）。

式中：N3為樣品中可溶部分含氮量，mg；N4為樣品總氮含量，mg。

1.3.5 酸溶性氮含量[15]

將樣品分散在10%三氯乙酸（trichloroaceticacid，TCA）溶液（樣品固形物含量不超過5%），45℃水浴振蕩15 min后，于2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移到凱氏消化管中，于90℃蒸干后，加入濃硫酸消化，按照文獻[14]測定氮含量，它與所取樣品中總氮含量比值即為酸溶性氮含量（TCA-NSI）。

式中：N5為樣品中TCA可溶部分含氮量，mg；N6為樣品總氮含量，mg。

1.3.6 分子質(zhì)量分布測定

采用高效液相色譜法測定[15]，TSK gel G2000 SWXL（7.8×300 mm）色譜柱，柱溫30℃，上樣量10 μL，流動相為乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1，流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm。用分子質(zhì)量已知的標準品作工作曲線。

1.3.7 超氧陰離子清除率測定

[16]方法。在試管中分別加入0.05 mol/L，pH 8.2的Tris-HCl緩沖液3.0 mL和待測樣品0.1 mL，用蒸餾水補至4.0 mL，再加入6.0 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.08 mL，迅速搖勻，于波長320 nm處每隔30 s測一次吸光度值（共測6次），以不加樣品和鄰苯三酚的溶液為空白調(diào)整儀器零點，對照組以蒸餾水來代替樣品，分別作吸光度值隨時間變化曲線的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率A。用下式來計算樣品對超氧陰離子的清除率。

式中：A對照為對照組鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min；A樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化速率，ΔA/min。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶水解小麥蛋白效率的比較

小麥蛋白具有較強的吸水特性，且吸水后形成面筋團，難以在水中分散。為了比較不同蛋白酶對小麥蛋白的水解效率，考查了幾種蛋白酶在各自最適酶解溫度和pH條件下，在加入相同酶活力單位（500 U/g）、相同反應時間（2.0 h）后小麥蛋白的水解度和溶解性能（見圖1）。

圖1 不同蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度和溶解性Fig.1 DH and NSI of different enzymatic hydrolysates

由圖1可知，在底物濃度、加酶量和反應時間均相同的條件下，不同酶制劑對小麥蛋白的水解效率有很大差別，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的水解效果遠不如堿性蛋白酶和復合蛋白酶。堿性和復合蛋白酶的水解度接近（分別為9.6%和8.9%），但堿性蛋白酶水解物的溶解性能不如復合蛋白酶（分別為36.2%和39.1%）。一般來講，用同一種酶水解時，酶解物的水解度越高其溶解性越好，但用不同酶制劑水解時，不一定呈現(xiàn)這種趨勢。這也反映兩種酶的水解特性差異，即由于酶切割位點的差異，即使DH相同，其酶解物的分子大小和組成未必相同，因而表現(xiàn)出不同的溶解性能。所以，該試驗選擇復合蛋白酶進一步研究酶解過程中小麥蛋白水解產(chǎn)物的成分特征及其抗氧化活性的變化。

2.2 不同酶解時間條件下小麥水解蛋白成分的特征

2.2.1 溶解性能的變化

在50℃、pH 7.0條件下，用復合蛋白酶水解小麥蛋白，分析不同酶解時間所得產(chǎn)物水解度、水溶性氮和酸溶性氮含量的變化，結(jié)果見圖2。

圖2 不同酶解進程中產(chǎn)物的性能指標Fig.2 DH,NSI and TCA-NSI of hydrolysates with different hydrolysis time

由圖2可知，酶解過程中，隨著水解時間的增加，酶解產(chǎn)物在水中和在三氯乙酸中的溶解性均呈增加趨勢，但三者之間的增加幅度并非同步，在起初的1 h內(nèi)，酶解物的水溶性比酸溶性的含量增加幅度大，酶解后期（3.5 h），酶解物的水溶性指標增加趨于平緩，而酸溶性蛋白仍保持較高的增加幅度，表明水溶性的蛋白質(zhì)分子繼續(xù)水解為更小的肽分子。本研究表明，以酸溶性蛋白含量為評價指標來確定最佳酶解時間更合適，最終選擇復合蛋白酶的最佳酶解時間為4 h。

2.2.2 酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布

分子質(zhì)量大小是蛋白質(zhì)或肽組分的重要特征，也是了解其溶解性和功能性變化的分子基礎。圖3是小麥蛋白經(jīng)復合蛋白酶水解1 h、2 h、3 h和4 h（分別以T1，T2，T3，T4表示）時產(chǎn)物的凝膠色譜圖，通過標準品蛋白質(zhì)/肽制作的標準曲線，確定不同分子質(zhì)量對應的保留時間，將其分為8個分子量區(qū)間，按歸一化法計算各區(qū)間組分的比例（見圖4）。

由圖3、圖4可以看出，隨著酶解時間的延長，各區(qū)間組分的比例發(fā)生規(guī)律性變化，且不同酶解時間的產(chǎn)物組分在多個區(qū)間的相對比例有較大差異，而在分子質(zhì)量為500～1000u區(qū)間的相對含量變化不大。蛋白質(zhì)酶解過程中的分子質(zhì)量逐漸變小，其中500～1 000 u區(qū)間不是最后的區(qū)間，其成分不是固定不變的，而是處于動態(tài)變化中，即：酶解過程中較大分子降解后會生成該區(qū)間的成分，同時該區(qū)間原有的部分成分會降解為更小的分子。水解物的溶解性能、分子質(zhì)量分布及其超氧離子清除能力。對比分析各項指標的變化規(guī)律，結(jié)果表明，隨著酶解時間延長，各項指標變化趨勢一致，但其變化幅度并非相同，最終選擇4 h為最佳酶解時間。這反映了蛋白質(zhì)酶解物的超氧陰離子清除能力具有較復雜的分子機制，有待于深入研究。

圖3 不同酶解時間條件下產(chǎn)物的凝膠色譜圖Fig.3 Gel chromatography of hydrolysates with different hydrolysis time

圖4 不同酶解時間水解物分子質(zhì)量分布比例Fig.4 Proportion of molecular weight of different hydrolysates

2.3 小麥水解蛋白的超氧陰離子清除能力

圖5表示不同酶解時間所得產(chǎn)物清除超氧陰離子的能力大小。可以看出，隨著酶解時間的延長，其超氧陰離子清除率提高，但與產(chǎn)物水解度DH、溶解性的變化幅度（圖2）并非完全吻合，在酶解1 h和2 h時其清除率值很?。ǚ謩e為5.58%和12.62%），酶解3 h和4 h時酶解產(chǎn)物的清除率分別為27.39%和28.51%，即酶解時間超過3 h后，雖然酶解產(chǎn)物中小分子肽的含量增加，但其抗氧化活性增加幅度較小。說明較小的肽分子有利于表現(xiàn)抗氧化活性，長短不一的肽分子之間還可能有一定的協(xié)調(diào)作用。文獻[12]中大豆肽分子的抗氧化活性也有類似現(xiàn)象。本研究以酶解物清除超氧陰離子的能力為指標，確定復合蛋白酶的最優(yōu)酶解時間為4 h。

圖5 不同酶解時間對超氧陰離子清除率的影響Fig.5 Effect of different hydrolysis time on clearance ratio of superoxide anion

3 結(jié)論

本研究以小麥蛋白為原料，首先以酶解物的溶解性能為指標比較了幾種常用蛋白酶的水解效率，在此基礎上，選擇酶解效率較高的復合蛋白酶，深入研究酶解過程中

參考文獻：

[1]EWASCHUK J B,MURDOCH G K,JOHNSON IR,et al.Glutamine supplementation improves intestinal barrier function in a weaned piglet model ofEscherichia coliinfection[J].Brit J Nutr,2011,106(6):870-877.

[2]CHAMORRO S,BLAS C,GRANT G,et al.Effect of dietary supplementation with glutamine and a combination of glutamine-arginine on intestinal health in 25-d-old weaned rabbits[J].J Anim Sci,2009,88(1):170-180.

[3]VAN ZWOL A,NEU J,VAN ELBURG R M.Long-term effects of neonatal glutamine-enriched nutrition in very-low-birth-weight infants[J].Nutr Rev,2011,69(1):2-8.

[4]HAYNES T E,LI P,LIU X L,et al.L-Glutamine or L-alanyl-L-glutamine prevents oxidant-or endotoxin-induced death of neonatal enterocytes[J].Amino Acids,2009,37(1):131-142.

[5]CRUZAT V F,BITTENCOURT A,SCOMAZZON S P.Oral free and di-peptide forms of glutamine supplementation attenuate oxidative stress and inflammation induced by endo-toxemia[J].Nutrition,2014,30(5):602-611.

[6]肖 香，錢靜亞，崔鳳杰，等.堿性蛋白酶降解小麥面筋蛋白制備抗氧化產(chǎn)物的工藝優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（8）：38-40.

[7]馬洪龍，韓 飛，李愛科.堿性蛋白酶水解小麥面筋蛋白制取谷氨酰胺肽的研究[J].糧油食品科技，2014，2（1）：54-57.

[8]楊得勝，張源淑，鄒思湘.水解面筋蛋白高效制備谷氨酰胺結(jié)合肽的研究[J].食品科學，2006，27（9）：181-185.

[9]SUETSUNA K,CHEN J R.Isolation and characterization of peptides with antioxidant activity derived from wheat gluten[J].Food Sci Technol Res,2002,8(3):227-230.

[10]王章存，張子峰，張新武，等.一種測定蛋白質(zhì)或其水解物中結(jié)合態(tài)谷氨酰胺含量的方法.中國，CN 201410131180.7[P].2014-04-03.

[11]劉樹興，喬曉林.木瓜蛋白酶酶解谷朊粉制備抗氧化多肽的[J].食品工業(yè)科技，2013，34（21）：167-171.

[12]林 琳，崔鳳杰，閆桂強.不同分子量小麥面筋蛋白酶解多肽的分離及其抗氧化活性研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2010，23（8）：34-36.

[13]中國調(diào)味品協(xié)會.GB 18186—2000釀造醬油[S].北京：中國標準出版社，2000.

[14]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5009.5—2010食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定[S].北京：中國標準出版社，2010.

[15]全國糧油標準化技術(shù)委員會.GB/T 22492—2008大豆肽粉[S].北京：中國標準出版社，2008.

[16]王章存，徐 賢.酶解大豆蛋白制取超氧陰離子清除活性肽的研究[J].食品工業(yè)科技，2008，29（10）：142-145.