曹申文+蒲金基+張欣+漆艷香+韋運(yùn)謝+劉曉妹

摘要：為了明確蛋白激酶CCK1在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能，在前期研究基礎(chǔ)上通過(guò)PCR擴(kuò)增，獲得了該基因1 604 bp的5′端片段（L-C5）和131 bp的3′端片段（L-C3），同時(shí)以pCAMBIA3300質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得了552 bp抗性標(biāo)記基因（L-Bar），并用In-Fusion HD Cloning Kit將L-Bar基因反向插入了L-C5和L-C3序列之間，克隆至pUC19載體上，成功構(gòu)建了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C。再?gòu)脑撦d體上擴(kuò)增互補(bǔ)片段，借助PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體的原生質(zhì)體，經(jīng)Basta平板篩選、PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定表明，獲得了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。為進(jìn)一步明確CCK1基因在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能打下了材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：多主棒孢菌;蛋白激酶基因CCK1;⊿CCK1突變體;互補(bǔ)載體;互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子

中圖分類(lèi)號(hào)： S435 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0027-03

收稿日期：2014-10-15

基金項(xiàng)目：中西部高校項(xiàng)目（編號(hào)：ZXBJH-XK005）;海南大學(xué)青年基金（編號(hào)：qnjj1212）;海南大學(xué)科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：kyqd1427）。

作者簡(jiǎn)介：曹申文（1990—），女，碩士研究生，主要從事植物病原真菌分子生物學(xué)研究。E-mail：hongshangcsw@qq.com。

通信作者：劉曉妹，博士，副教授，主要從事熱帶作物病害病原菌致病基因研究。E-mail：lxmpll@126.com。

由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola （Bert.&Curt.）Wei]引起的巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病是巴西橡膠樹(shù)的重要病害之一，現(xiàn)已在世界天然橡膠生產(chǎn)國(guó)普遍分布，該病害常造成橡膠樹(shù)周年反復(fù)落葉，植株生長(zhǎng)遲緩，枝條回枯或整株死亡，一般膠乳減產(chǎn)20%～45%[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)該病害的研究在病害診斷、病原菌生物學(xué)、病害流行學(xué)和防治技術(shù)等方面取得了較大進(jìn)展[3-7]，但在分子生物學(xué)研究方面僅報(bào)道了4個(gè)致病相關(guān)基因CCK1[8]、CMP1[9]、CCHog1[10]、cas[11]，且大多處于序列特征分析階段。其中，CCK1是本實(shí)驗(yàn)室從巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中克隆獲得的一個(gè)PMK1類(lèi)促分裂原活化蛋白激酶基因[12]，經(jīng)前期鑒定，初步確定CCK1基因可能在多主棒孢菌的菌落和菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢、對(duì)環(huán)境的識(shí)別、毒素的產(chǎn)生以及致病性等方面起重要作用，并參與調(diào)控高滲脅迫反應(yīng)[8]。但這些功能仍需通過(guò)互補(bǔ)突變體試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步明確，而通過(guò)構(gòu)建其互補(bǔ)載體和轉(zhuǎn)化突變菌株獲得互補(bǔ)菌株是關(guān)鍵步驟。本研究以Bar基因?yàn)榭剐赃x擇標(biāo)記，用In-Fusion HD Cloning Kit成功構(gòu)建了⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCKB，并轉(zhuǎn)化了⊿CCK1突變株的原生質(zhì)體，獲得 ⊿CCK1 互補(bǔ)菌株，為明確CCK1基因的功能、揭示巴西橡膠樹(shù)棒孢霉病菌致病機(jī)制打下了材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株和質(zhì)粒：巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病病菌CC004菌株和含Bar基因的質(zhì)粒pCAMBIA3300，均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。CCK1基因突變體 ⊿CCK1 由筆者所在課題組提供。

供試試劑：Fungal gDNA Kit 和Mini Plasmid Kit 為BioMiga 公司產(chǎn)品;In-Fusion HD Cloning Kit為Clontech 公司產(chǎn)品;Peasy-T1和大腸感受態(tài)大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α為T(mén)ransGen Biotech公司產(chǎn)品;2×（HS）Taq-Mixture Kit 和TIANgel Midi Purification Kit為T(mén)IANGEN公司產(chǎn)品;核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自廣東省廣州東盛生物科技有限公司;GoldView DNA染料購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;溶壁酶購(gòu)自廣東省微生物研究所;Ampicillin和Basta為Amresco進(jìn)口分裝;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純;引物合成和測(cè)序均由華大基因生物科技有限公司（深圳）完成。 供試引物見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 接種巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌CC004菌餅于PD培養(yǎng)液中，28 ℃、150 r/min、黑暗搖床培養(yǎng)4～5 d，收集菌絲，用Fungal gDNA Kit提取基因組DNA。 1.2.2 ⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體構(gòu)建 先以野生菌株CC004的gDNA和質(zhì)粒pCAMBIA3300為模板，分別擴(kuò)增CCK1基因5′端片段C5（包含CCK1基因編碼區(qū)上游序列和CCK1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列）、3′端片段C3（CCK1基因終止密碼子后的一段序列）及完整的Bar基因，分別克隆于Peasy-T1載體上，選擇陽(yáng)性克隆測(cè)序，再以序列完全正確的陽(yáng)性克隆為模板，分別擴(kuò)增含同源重組序列的CCK1基因5′端、3′端和Bar片段L-C5、L-C3、L-Bar。純化擴(kuò)增產(chǎn)物，再用In-Fusion HD Cloning Kit 將L-Bar基因反向連接于 L-C5 和L-C3之間，連接至pUC19載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，用pUC19載體通用引物檢測(cè)克隆，挑陽(yáng)性克隆測(cè)序，篩選插入片段序列沒(méi)有堿基錯(cuò)配的克隆提取質(zhì)粒，即完成CCK1基

表1 所用引物信息

序號(hào) 擴(kuò)增片段 引物序列

1 C5：CCK1基因上游 F：5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′

2 C3：CCK1基因下游 F：5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R：5′-CGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

3 Bar：除草劑Bar基因 F：5′-ATGAGCCCAGAACGACGC-3′;R：5′-TCTCAAATCTCGGTGACG-3′

4 L-C5：CCK1基因上游重疊片段 F：5′-CGGTACCCGGGGATCCCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GAGTCATACAGCCGAGCC-3′

5 L-C3：CCK1基因下游重疊片段 F：5′-GGTGCCATGTCTGAGCA-3′;R：5′-CGACTCTAGAGGATCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

6

L-Bar：除草劑Bar基因重疊片段

F：5′-TCGGCTGTATGACTCTCAAATCTCGGTGACG-3′;R：5′-CTCAGACATGGCACCATGAGCCCAGAACGACGC-3′

7 pUC19載體通用引物 F：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′;R：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′

8 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)片段 F：5′-CCCGTTCATTGTCCCA-3′;R：5′-GGTAACAGGCAGGATTAGAT-3′

9 FBB：檢測(cè)轉(zhuǎn)化子特異性引物 F：5′-TGGTGGAACAATGGCTAATGG-3′;R：5′-GCCGAGGAAATCCTAGAGTTTG-3′

注：邊框部分序列為L(zhǎng)-C5或L-C3與pUC19載體重疊序列;劃單線部分序列為L(zhǎng)-Bar與片段L-C5或L-C3重疊序列。

因互補(bǔ)載體的構(gòu)建（圖1）。

（1）目的片段擴(kuò)增。構(gòu)建CCK1基因互補(bǔ)載體所需引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增體系（50 μL）：gDNA或質(zhì)粒pCAMBIA3300 2 μL、dNTPs（各2.5 mmol/L） 5 μL、上或下游引物 （10 μmol/L）各2 μL、5×TransStart FastPfu buffer 10 μL、TransStart FastPfu DNA Polymerase （2.5 U/μL） 1 μL、ddH2O 28 μL。C5/L-C5擴(kuò)增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)35周;72 ℃ 10 min，預(yù)期大小約為 1 600 bp。C3/L-C3擴(kuò)增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35周;72 ℃ 5 min，預(yù)期大小約 100 bp。Bar/L-Bar擴(kuò)增程序：95 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35周;72 ℃ 5 min，預(yù)期大小約550 bp。

（2）互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C的生成。連接體系20 μL：pUC19 Control Vector Linearized （50 ng/μL） 2.0 μL、Purified products（100～200 ng/μL）2.0 μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix（5 U/μL）6.0 μL、ddH2O 6.0 μL。上述混合液50 ℃ 孵育15 min后，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。并用pUC19載體通用引物檢測(cè)克隆，預(yù)期片段大小約為2 400 bp。送陽(yáng)性克隆測(cè)序，將序列完全正確重組質(zhì)粒命名為p⊿CCK1-C，即獲得了⊿CCK1突變體互補(bǔ)載體。

1.2.3 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的獲得和PCR驗(yàn)證

1.2.3.1 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)片段的擴(kuò)增 以L-C5：：Bar：：L-C3基因序列設(shè)計(jì)引物CCKB-F/R，以p⊿CCK1-C為模板，擴(kuò)增一段含完整CCK1基因、Bar基因和CCK1基因終止密碼子后一段序列的片段。擴(kuò)增體系同上。擴(kuò)增條件：95 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min 30 s，循環(huán)35周;72 ℃ 10 min。該片段預(yù)期大小2 196 bp。用TIANgel Midi Purification Kit回收該片段?？寺y(cè)序正確后，再純化用作互補(bǔ)片段。

1.2.3.2 互補(bǔ)片段的轉(zhuǎn)化 參照劉曉妹的方法[1]，將回收的片段在PEG介導(dǎo)作用下轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體原生質(zhì)體，用含 4 mg/mL Basta（對(duì)CC004和⊿CCK1菌株的最低抑菌濃度）的PDS培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28 ℃黑暗。待有菌落長(zhǎng)出后，用無(wú)菌牙簽蘸取邊緣菌絲，接于含4 mg/mL Basta的PDA平板上進(jìn)行連續(xù)5次純化。

1.2.3.3 互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的PCR驗(yàn)證 用Fungal gDNA Kit提取野生型菌株CC004、⊿CCK1突變體和純化后的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子基因組DNA。用特異性引物FBB-F/R進(jìn)行PCR鑒定，預(yù)期在野生型菌株CC004中擴(kuò)增到的條帶大小約1 100 bp，在⊿CCK1突變體中擴(kuò)增不到條帶，在互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子中能擴(kuò)增到約 1 600 bp 條帶的即為⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。將符合預(yù)期的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子條帶回收并克隆到Peasy-T1上并測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證序列的正確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌CC004基因組DNA的提取

從圖2可以看出，在15 000 bp以上位置有清晰條帶。可見(jiàn)所提取的CC004菌株的DNA比較完整，適合進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2 ⊿CCK1突變體的互補(bǔ)載體構(gòu)建

2.2.1 目的片段擴(kuò)增 C5、C3、Bar擴(kuò)增條帶分別在約 1 600、550、100 bp處，符合預(yù)期大?。▓D3）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)克隆測(cè)序后，選擇序列完全正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.2 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C的生成 以獲得序列正確的陽(yáng)性克隆為模板，用高保真酶擴(kuò)增回收L-C5、L-C3、L-Bar片段，用In-Fusion HD Cloning Kit 將其連接至pUC19載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選了12個(gè)克隆，用載體通用引物M13-F/R檢測(cè)，結(jié)果表明，在12個(gè)克隆中均擴(kuò)增到了約2 400 bp的片段（圖4），符合預(yù)期大小。測(cè)序結(jié)果表明，有3個(gè)陽(yáng)性克隆的序列完全正確，說(shuō)明 ⊿CCK1 突變體的互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C構(gòu)建成功。

2.3 ⊿CCK1突變體互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的獲得和PCR驗(yàn)證

以互補(bǔ)載體質(zhì)粒p⊿CCK-C為模板，用引物組合CCKB-F/R擴(kuò)增獲得了一段大小約2 200 bp的互補(bǔ)片段（圖5）。用該片段轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體原生質(zhì)體，經(jīng)過(guò)含Basta的平板篩選和純化后，提取基因組，用特異性引物FBB-F/R擴(kuò)增驗(yàn)證。結(jié)果表明，在野生型CC004基因組中擴(kuò)增到大小為

1 100 bp的條帶，在⊿CCK1突變體中未擴(kuò)增到條帶，在9個(gè)互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增到大小約為1 600 bp的條帶，送樣測(cè)序，其中3號(hào)樣與預(yù)期完全相符（圖6）。說(shuō)明⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子獲得成功。

3 結(jié)論與討論

基因敲入是通過(guò)同源重組的方法，將基因編碼序列用另一基因編碼序列進(jìn)行替換的技術(shù)。通過(guò)基因敲入，可以讓基因在體內(nèi)表達(dá)、研究其功能;也可以將正?；蛞牖蚪M中置換突變基因以達(dá)到驗(yàn)證其基因功能的目的[13]。本研究構(gòu)建的p⊿CCK1-C基因互補(bǔ)載體屬于置換型載體。已有文獻(xiàn)報(bào)道，在構(gòu)建基因敲除置換型載體時(shí)，目的基因兩端的同源序列越大，發(fā)生同源重組的概率越高。對(duì)于絲狀真菌而言，同源序列最好在500 bp以上[14]。且由于線性化質(zhì)粒相對(duì)于環(huán)形質(zhì)粒而言有可能更有利于提高轉(zhuǎn)化率，本試驗(yàn)以互補(bǔ)載體p⊿CCK1-C為模板擴(kuò)增長(zhǎng)片段序列進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)構(gòu)建的p⊿CCK1-C載體，同源片段為887 bp，置換片段與⊿CCK1突變體也仍有814 bp同源序列，符合置換載體的構(gòu)建要求。將置換片段PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化⊿CCK1突變體，成功獲得⊿CCK1突變體的互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。

傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法需要載體外對(duì)DNA 片段進(jìn)行繁瑣的酶切、連接、亞克隆和鑒定等步驟，費(fèi)力費(fèi)時(shí)[15]。本試驗(yàn)采用了Clontech公司的In-fusion克隆技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)相連片段附加15 bp同源堿基令不同片段進(jìn)行平末端連接，不附加多余序列，也不受限制性酶切位點(diǎn)的限制，簡(jiǎn)便、高效。

前期筆者所在課題組已成功獲得CCK1基因敲除突變體⊿CCK1，表型測(cè)定表明，⊿CCK1完全失去產(chǎn)孢能力菌餅接種時(shí)，⊿CCK1突變體致病力喪失，且在菌落和菌絲形態(tài)、對(duì)環(huán)境的識(shí)別、毒素的產(chǎn)生等方面也與野生型存在明顯的差異[8]。本研究將在后續(xù)試驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子表型，為進(jìn)一步明確CCK1在巴西橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病菌中的致病相關(guān)功能打下了良好的材料基礎(chǔ)。

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