吳海燕+袁秋梅

摘要：在425～525 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，掃描多糖-苯酚-硫酸顯色反應(yīng)體系零階及一階導(dǎo)數(shù)光譜圖，發(fā)現(xiàn)一階導(dǎo)數(shù)光譜的波峰與波谷間距值與多糖含量成正比。在一階導(dǎo)數(shù)光譜圖中，以波峰-波谷間距為縱坐標(biāo)、以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，建立了苯酚-硫酸顯色導(dǎo)數(shù)光譜測(cè)定蠶蛹多糖的方法。該測(cè)定方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.08%，平均回收率在99.46%～101.54%;顯色體系在120 min中穩(wěn)定性好，測(cè)定的準(zhǔn)確度、精密度高，可以用于蠶蛹中多糖含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：多糖-苯酚-硫酸顯色反應(yīng);導(dǎo)數(shù)光譜;蠶蛹多糖;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S131+.2;R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0309-03

收稿日期：2014-06-03

基金項(xiàng)目：江蘇省教育廳“青藍(lán)工程”資助項(xiàng)目（編號(hào)：201423）;江蘇省南通市農(nóng)村科技創(chuàng)新及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（編號(hào)：HL2012025）。

作者簡(jiǎn)介：吳海燕（1978—），女，江蘇南通人，副教授，主要從事食品綜合利用、食品安全檢測(cè)的研究。E-mail：why022@126.com。

蠶蛹為蠶蛹科昆蟲家蠶的蛹，具有生津止咳、消食理氣等作用，為藥膳同源傳統(tǒng)中藥材，具有很高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值。蠶蛹多糖是蠶蛹中的主要活性成分之一[1-2]。近年來(lái)研究表明，蠶蛹多糖具有明顯增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用[3-6]。

目前蠶蛹多糖的測(cè)定方法廣泛采用苯酚-硫酸法，此法雖簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需多糖純品和高級(jí)儀器，但要求被測(cè)溶液本身無(wú)顏色或顏色較淡[7]，而且由于蠶蛹本身有一定的顏色，會(huì)對(duì)測(cè)定產(chǎn)生較大干擾。因此蠶蛹在測(cè)定前一般要經(jīng)過(guò)脫色或其他處理，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，容易產(chǎn)生較大誤差;另外，蠶蛹多糖結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，僅僅用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品不能精確反映多糖含量。

導(dǎo)數(shù)光譜又稱微分光譜，是將吸收光譜進(jìn)行數(shù)學(xué)變換，得到關(guān)于波長(zhǎng)的微分系數(shù)（dA/dλ）對(duì)波長(zhǎng)（λ）的導(dǎo)數(shù)光譜圖，屬于紫外吸收光譜派生的1個(gè)分支[8]。對(duì)于復(fù)雜的多組分物質(zhì)，導(dǎo)數(shù)光譜可不經(jīng)分離而直接檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏;導(dǎo)數(shù)光譜法對(duì)重疊譜帶及平坦譜帶的分辨率高、噪聲低，能從重疊的吸收光譜中分離出各自的吸收峰，并能分別進(jìn)行定量，可排除雜質(zhì)和顏色的干擾[9-10]。因此導(dǎo)數(shù)光譜法近年來(lái)在食品、藥品鑒別分析測(cè)定領(lǐng)域得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用[11-14]。本試驗(yàn)采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定蠶蛹多糖含量，以期為蠶蛹多糖的開發(fā)利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

蠶蛹粉由南通福爾生物制品有限公司提供;葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)，北京通用普析儀器有限責(zé)任公司;DZF-6020真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SHA-C數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇市精達(dá)儀器制造廠;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的提取 稱取5 g脫脂蠶蛹粉末，加入100 mL蒸餾水，在功率為500 W的超聲波中提取30 min，過(guò)濾，濾液為粗多糖提取液。

1.3.2 多糖的測(cè)定

1.3.2.1 線性關(guān)系分析 精確量取0、0.10、0.20、0.30、040、0.50、0.60、0.70、0.80 mL 0.1mg/mL葡萄糖溶液，分別置于10 mL干燥比色管中，加蒸餾水至體積為1.00 mL，加入 0.50 mL 一定濃度的精制苯酚溶液，混勻后迅速加入濃H2SO4，放置于水浴鍋中加熱一定時(shí)間，取出冷卻至室溫。用TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)在420～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄葡萄糖的零階和一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜，以一階導(dǎo)數(shù)光譜中波峰與波谷間距對(duì)葡萄糖含量進(jìn)行直線回歸。

1.3.2.2 樣品的測(cè)定 將蠶蛹多糖提取液定容至250 mL，取10 mL提取液定容至100 mL待測(cè)，精確吸取待測(cè)液 100 mL 置于10 mL干燥比色管中，按“1.3.2.1”節(jié)方法繪制零階和一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜。將一階導(dǎo)數(shù)光譜中波峰與波谷間距值代入直線回歸曲線，求得樣品的多糖含量。

1.3.3 苯酚-硫酸法的顯色條件優(yōu)化 以苯酚濃度（A）、濃硫酸用量（B）、水浴溫度（C）、水浴時(shí)間（D）為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)確定苯酚-硫酸法顯色的最優(yōu)試驗(yàn)條件，詳見表1。

表1 苯酚-硫酸法顯色條件正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

水平

因素

A：苯酚濃度

（%） B：濃硫酸

的量（mL） C：水浴溫度

（℃） D：水浴時(shí)間

（min）

1 4 3 30 10

2 5 4 65 15

3 6 5 100 20

1.3.4 精密度試驗(yàn) 取6份同一批次的脫脂蠶蛹樣品，按照“1.3.1”節(jié)的方法進(jìn)行多糖的提取，提取后的每份試樣按照“1.3.2.2”節(jié)的方法求得的一階導(dǎo)數(shù)光譜中波峰與波谷間距值，測(cè)定蠶蛹多糖含量來(lái)確定方法的精密度。

1.3.5 回收率試驗(yàn) 精確稱取5 g蠶蛹樣品，加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，分別制備添加量為4、8、16 mg/g的樣品，每個(gè)添加量均測(cè)定6個(gè)平行樣，按“1.3.1”節(jié)的方法提取后，按“1.3.2”節(jié)的方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算多糖的回收率。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精確稱取適量多糖樣品，按照“1.3.1”節(jié)的方法進(jìn)行多糖的提取，按“1.3.2”節(jié)的方法顯色后每隔30 min測(cè)定其一階光譜導(dǎo)數(shù)值的波峰與波谷間的間距值變化。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 導(dǎo)數(shù)光譜試驗(yàn)

取葡萄糖對(duì)照品、空白溶液、蠶蛹多糖提取液，分別在420～550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，記錄葡萄糖的吸收光譜（圖1）;利用UVWin5.0軟件對(duì)葡萄糖零階吸收光譜求導(dǎo)，得到葡萄糖一階導(dǎo)數(shù)光譜（圖2）。一階導(dǎo)數(shù)光譜在425～525 nm間波峰-波谷間距值（dA/dλ）與葡萄糖含量進(jìn)行直線回歸（圖3），可見一階導(dǎo)數(shù)光譜在425～525 nm間的dA/dλ與葡萄糖含量成正比，因此選擇一階導(dǎo)數(shù)光譜在425～525 nm間的波峰-波谷間距值作為定量的依據(jù)。

2.2 顯色條件的選擇

苯酚-硫酸法顯色原理為：多糖類物質(zhì)在硫酸作用下先水解成單糖分子，并迅速脫水成糖醛衍生物，糖醛衍生物再與酚性物質(zhì)（如苯酚）絡(luò)合成有色物質(zhì)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此有色物質(zhì)的一階導(dǎo)數(shù)光譜在425～525 nm間的波峰-波谷間距值定量效果最好。正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)和極差分析結(jié)果見表2。

正交試驗(yàn)中極差的大小反映各個(gè)因素對(duì)測(cè)定指標(biāo)影響程度，根據(jù)表2的極差分析可知，各因素對(duì)波峰-波谷間距值影

表2 苯酚-硫酸法顯色條件正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析

編號(hào) A：苯酚

濃度 B：濃硫酸

的量 C：水浴

溫度 D：水浴

時(shí)間 dA/dλ

1 1 1 1 1 0.016

2 1 2 2 2 0.032

3 1 3 3 3 0.023

4 2 1 1 3 0.023

5 2 2 3 1 0.021

6 2 3 1 2 0.028

7 3 1 3 2 0.036

8 3 2 1 3 0.032

9 3 3 2 1 0.032

k1 0.024 0.025 0.025 0.023

k2 0.024 0.028 0.029 0.032

k3 0.033 0.028 0.027 0.026

R 0.009 0.003 0.004 0.009

注：dA/dλ為一階導(dǎo)數(shù)光譜在425～525 nm間的波峰與波谷間距值。

響程度為：A= D>C>B，苯酚-硫酸法的最佳顯色條件為 A3B2C2D2組合，即苯酚的濃度為6%，濃硫酸的用量為4 mL，水浴溫度65 ℃，水浴時(shí)間為15 min。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖一階導(dǎo)數(shù)吸收光譜在425～525 nm 間的波峰-波谷間距（dA/dλ）為縱坐標(biāo)、葡萄糖含量（m）為橫坐標(biāo)求得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），回歸方程為：dA/dλ=0.582 1m+0.001 4，r2=0.998 2。結(jié)果表明，葡萄糖濃度在1.81～14.55 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

蠶蛹多糖含量的精密度試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.08%，表明采取一階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定蠶蛹中多糖含量的方法重現(xiàn)性較好。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

蠶蛹樣品 蠶蛹多糖含量（mg/g）

平行樣1 20.271

平行樣2 21.130

平行樣3 21.130

平行樣4 20.271

平行樣5 21.989

平行樣6 21.130

平均值 20.987

精密度RSD 3.08%

2.5 回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)結(jié)果表明，添加量為4 mg/g的樣品，平均回收率為99.46%，RSD值為2.82%;添加量為8 mg/g的樣品，平均回收率為101.54%，RSD值為2.38%;添加量為16 mg/g的樣品，平均回收率為101.25%，RSD值為2.05%，表明采用一階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定蠶蛹中多糖含量的方法準(zhǔn)確可靠，符合定量分析的準(zhǔn)確度要求。多糖的回收率結(jié)果見表4。

表4 回收率試驗(yàn)結(jié)果

樣品

序號(hào) 樣品中含

量（mg/g） 加標(biāo)量

（mg/g） 測(cè)定值

（mg/g） 回收率

（%） RSD值

（%）

1 20.987 4 24.566 98.31

2 20.987 4 25.425 101.75

3 20.987 4 24.566 98.31

4 20.987 4 23.707 94.87

5 20.987 4 25.425 101.75

6 20.987 4 25.425 101.75

1～6平均 99.46 2.82

7 20.987 8 29.720 102.53

8 20.987 8 28.861 99.57

9 20.987 8 28.861 99.57

10 20.987 8 28.861 99.57

11 20.987 8 29.720 102.53

12 20.987 8 30.579 105.49

7～12平均 101.54 2.38

13 20.987 16 36.592 98.93

14 20.987 16 38.310 103.57

15 20.987 16 38.310 103.57

16 20.987 16 37.451 101.25

17 20.987 16 37.451 101.25endprint

18 20.987 16 36.592 98.93

13～18平均 101.25 2.05

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

表5穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，蠶蛹多糖一階導(dǎo)數(shù)光譜的波峰與波谷間距值在顯色后30 min達(dá)到最大，在120 min內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD值為2.72%。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

時(shí)間（min） dA/dλ

0 0.026

30 0.027

60 0.026

90 0.026

120 0.025

150 0.021

3 結(jié)論

導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定多糖能消除背景顏色的干擾，可以使蠶蛹多糖不經(jīng)脫色處理直接測(cè)定，提高了測(cè)定準(zhǔn)確度，避免了由于脫色導(dǎo)致多糖的損失。

本試驗(yàn)利用一階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定蠶蛹多糖含量。通過(guò)試驗(yàn)優(yōu)化最佳顯色條件為：苯酚的濃度為6%，濃硫酸的用量為4 mL，水浴溫度為65 ℃，水浴時(shí)間為15 min。顯色反應(yīng)體系的一階導(dǎo)數(shù)光譜值與多糖含量成正比，回歸方程為：dA/dλ=0.582 1m+0.001 4，r2=0.998 2。測(cè)定方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.08%，平均回收率在99.46%～101.54%之間，顯色體系在120 min中穩(wěn)定性好，測(cè)定的準(zhǔn)確度和精密度高，可以用于蠶蛹中多糖含量的測(cè)定。

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