王曉峨+劉恩玲

（1.溫州科技職業(yè)學(xué)院，浙江溫州 325006; 2.浙江省溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究所，浙江溫州 325006）

摘要：為了研究殼聚糖-銅的抑菌性能，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定2種脫乙酰度殼聚糖-銅對(duì)番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄黑霉病菌（Alternaria brassicicola） 2種真菌的抑菌效果。結(jié)果表明，2種脫乙酰度殼聚糖-銅均具有抑菌作用，脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅抑菌效果最好，2種脫乙酰度的殼聚糖-銅最佳濃度為30 g/L。

關(guān)鍵詞：殼聚糖-銅;灰霉病;黑霉病;抑菌作用;番茄

中圖分類號(hào)： S482.2+5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0160-02

收稿日期：2014-05-19

基金項(xiàng)目：浙江省溫州市農(nóng)業(yè)科技計(jì)劃 （編號(hào)：S20100010）。

作者簡(jiǎn)介：王曉峨（1980—），女，博士，副教授，主要從事植物病理學(xué)教學(xué)與科研工作。E-mail：wangxe_ch@163.com。

含銅化合物是常用的抗菌劑，既能防治真菌性病害，又能防治細(xì)菌性病害[1-2]。田間直接應(yīng)用含銅化合物容易造成局部銅離子濃度過(guò)高，影響作物生長(zhǎng)，造成藥害，同時(shí)存在藥效維持時(shí)間較短的缺陷，并對(duì)生態(tài)環(huán)境造成不良影響[3-6]。開(kāi)發(fā)載體化銅制劑，使銅離子附著于載體上以低濃度緩慢釋放，既可避免銅離子濃度過(guò)高產(chǎn)生藥害，又可以延長(zhǎng)藥效期。殼聚糖（CTS）作為目前自然界唯一發(fā)現(xiàn)的堿性多糖類天然高分子，在抑制真菌、細(xì)菌、病毒等方面效果較好[7-9]，同時(shí)殼聚糖是一種優(yōu)良的載體材料。殼聚糖與金屬離子螯合后可增加抑菌效果[10-11]。本研究利用殼聚糖對(duì)金屬離子的吸附與螯合作用，開(kāi)發(fā)具有緩釋性能的殼聚糖銅殺菌劑，采用脫乙酰度為90%、95%的殼聚糖作為銅素殺菌劑的載體，利用2種植物病原真菌對(duì)其抑菌性能進(jìn)行試驗(yàn)，比較2種不同脫乙酰度殼聚糖銅素復(fù)合物的抑菌性能，以期篩選出最佳抑菌性能的殼聚糖-銅復(fù)合物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 將8.0 g硫酸銅溶于400 mL蒸餾水中，滴加硫酸調(diào)節(jié)pH值為4～5，加入脫乙酰度分別為90%、95%的殼聚糖10.0 g，40 ℃水浴恒溫振蕩90 min，抽濾干燥待用。

1.1.2 供試菌種 供試菌種番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄黑霉病菌（Alternaria brassicicola）均采自田間發(fā)病番茄果實(shí)，經(jīng)常規(guī)組織分離法，按照柯赫氏法則進(jìn)行驗(yàn)證所得。

1.1.3 PDA瓊脂培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。

1.1.4 基礎(chǔ)培養(yǎng) 將2種病原菌分別在PDA瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)皿直徑均為90.0 mm。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖-銅抑菌試驗(yàn) 采用生長(zhǎng)速率法進(jìn)行室內(nèi)抑菌效果測(cè)定，先將供試的脫乙酰度為90%、95%的殼聚糖-銅制成10、20、30、35 g/L濃度梯度的含藥培養(yǎng)基，同時(shí)以不含藥的培養(yǎng)基作為對(duì)照，各處理及對(duì)照均設(shè)3次重復(fù)。無(wú)菌條件下，將培養(yǎng)好的病原菌用直徑為4 mm的打孔器打取菌餅，然后用接種鏟將菌餅接入含藥的培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基正中央，菌絲面朝下，置于25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后測(cè)量病原菌在不同濃度脫乙酰度90%的殼聚糖-銅培養(yǎng)基上的菌落直徑，計(jì)算不同濃度脫乙酰度為90%、95%的殼聚糖-銅對(duì)菌落的生長(zhǎng)抑制率。

1.2.2 殼聚糖-銅的抑菌效果計(jì)算 抑制率計(jì)算公式如下：

抑制率=對(duì)照組菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照組菌落直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫乙酰度為90%的殼聚糖-銅對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌效果

表1表明，番茄灰霉病菌在不含藥劑PDA瓊脂培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)5 d菌絲直徑可達(dá)83.0 mm，含不同濃度的脫乙酰度90%殼聚糖-銅對(duì)番茄灰霉病菌均具有一定的抑菌效果。當(dāng)脫乙酰度90%殼聚糖-銅濃度達(dá)30 g/L時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌效果最好，抑菌率達(dá)61.2%，繼續(xù)增加濃度，抑菌效果下降。因此，脫乙酰度90%的殼聚糖-銅的最佳使用濃度為30 g/L。

表1 脫乙酰度90%的殼聚糖-銅對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果

殼聚糖-銅

濃度（g/L）

菌落直徑（mm）

重復(fù)Ⅰ 重復(fù)Ⅱ 重復(fù)Ⅲ 平均值

抑菌率

（%）

10 61.0 60.0 61.0 60.7 26.9bB

20 50.5 48.0 50.0 49.5 40.4cC

30 33.5 32.0 31.0 32.2 61.2eE

35 44.5 45.0 43.0 44.2 46.7dD

0（CK） 83.0 83.0 83.0 83.0 0aA

注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著（P<0.01），不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（P<0.05）。下表同。

2.2 脫乙酰度95%的殼聚糖-銅對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌效果

表2表明，不同濃度脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅對(duì)番茄灰霉病菌均具有抑菌效果，當(dāng)脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅濃度為30 g/L時(shí)，對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌效果最好，抑菌率達(dá)87.7%，且該濃度藥劑可導(dǎo)致菌落生長(zhǎng)趨于老化，菌落邊緣菌絲稀疏，綜合抑菌效果明顯，繼續(xù)增加濃度，抑菌效果下降。因此，脫乙酰度95%殼聚糖-銅的最佳使用濃度為 30 g/L。脫乙酰度95%殼聚糖-銅對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果比脫乙酰度為90%殼聚糖-銅抑菌效果更明顯，抑菌效果更好。endprint

表2 脫乙酰度95%的殼聚糖-銅對(duì)番茄灰霉病菌的抑制效果

殼聚糖-銅

濃度（g/L）

菌落直徑（mm）

重復(fù)Ⅰ 重復(fù)Ⅱ 重復(fù)Ⅲ 平均值

抑菌率

（%）

10 37.5 36.0 35.0 36.2 56.4bB

20 26.5 25.0 25.5 25.7 69.0cC

30 11.0 9.5 10.0 10.2 87.7eE

35 20.5 21.0 22.5 21.3 74.3dD

0（CK） 83.0 83.0 83.0 83.0 0aA

2.3 脫乙酰度為90%的殼聚糖-銅對(duì)番茄黑霉病菌的抑菌效果

表3表明，番茄黑霉病菌在不含藥劑PDA瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)5 d菌絲直徑可達(dá)74.0 mm，含不同濃度的脫乙酰度為90%的殼聚糖-銅對(duì)番茄黑霉病菌均具有一定的抑菌效果。當(dāng)脫乙酰度為90%的殼聚糖-銅濃度達(dá)到30 g/L時(shí)對(duì)番茄黑霉病菌的抑菌效果最好，抑菌率達(dá) 59.9%，繼續(xù)增加濃度，抑菌效果下降。因此，脫乙酰度為90%的殼聚糖-銅的最佳使用濃度為30 g/L。

表3 脫乙酰度90%的殼聚糖-銅對(duì)番茄黑霉病菌的抑制效果

殼聚糖-銅

濃度（g/L）

菌落直徑（mm）

重復(fù)Ⅰ 重復(fù)Ⅱ 重復(fù)Ⅲ 平均值

抑菌率

（%）

10 53.5 54.0 55.5 54.3 26.8bB

20 37.5 36.0 38.0 37.2 49.7eE

30 30.5 29.0 29.5 29.7 59.9dD

35 40.5 43.0 41.0 41.5 43.9cC

0（CK） 74.0 74.0 74.0 74.0 0aA

2.4 脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅對(duì)番茄黑霉病菌的抑菌效果

表4表明，不同濃度的脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅對(duì)番茄黑霉病菌均具有一定的抑菌效果，當(dāng)脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅濃度為30 g/L時(shí)，對(duì)番茄黑霉病菌的抑菌效果最好，抑菌率達(dá)82.7%，且該濃度藥劑可導(dǎo)致菌落生長(zhǎng)趨于老化，菌落邊緣菌絲稀疏，綜合抑菌效果明顯，繼續(xù)增加濃度，抑菌效果下降。因此，脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅的最佳使用濃度為30 g/L。 脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅對(duì)番茄黑霉病菌的抑制效果比脫乙酰度為90%的殼聚糖-銅抑菌效果更明顯，抑菌效果更好。

表4 脫乙酰度95%的殼聚糖-銅對(duì)番茄黑霉病菌的抑制效果

殼聚糖-銅

濃度（g/L）

菌落直徑（mm）

重復(fù)Ⅰ 重復(fù)Ⅱ 重復(fù)Ⅲ 平均值

抑菌率

（%）

10 38.5 39.0 40.0 39.2 47.0bB

20 23.5 22.0 24.0 23.2 68.6dC

30 14.0 12.5 12.0 12.8 82.7eD

35 25.5 27.0 25.5 26.0 64.9cC

0（CK） 74.0 74.0 74.0 74.0 0aA

3 結(jié)論

2種脫乙酰度殼聚糖銅素復(fù)合物對(duì)2種病原菌的抑菌效果測(cè)試結(jié)果表明，2種復(fù)合物都具有一定的抑菌作用，相比較而言，脫乙酰度為95%的殼聚糖-銅的抑菌效果更好，這與前人研究結(jié)論[12]相符。2種脫乙酰度的殼聚糖-銅的最佳抑菌濃度均為30 g/L。

參考文獻(xiàn)：

[1]史有艷. 銅素殺菌劑及其合理應(yīng)用[J]. 農(nóng)村科技開(kāi)發(fā)，2004（2）：28.

[2]韓 林，韓學(xué)齋，尹樹(shù)玳. 銅素殺菌劑的種類及使用[J]. 河北果樹(shù)，2002（2）：31-32.

[3]常紅巖，孫百曄，劉春生. 植物銅素毒害研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000，31（2）：227-230.

[4]史學(xué)功，張建梅，張祥申. 談?wù)勩~制劑的藥害及其預(yù)防[J]. 煙臺(tái)果樹(shù)，2005（3）：48.

[5]蔡道基，單正軍，朱忠林，等. 銅制劑農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境影響研究[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，3（1）：61-68.

[6]倪吾鐘，馬海燕，余 慎，等. 土壤-植物系統(tǒng)的銅污染及其生態(tài)健康效應(yīng)[J]. 廣東微量元素科學(xué)，2003，10（1）：1-5.

[7]Tikhonov V E，Stepnova E A，Babak V G，et al. Bactericidal and antifungal activities of a low molecular weight chitosan and its N-/2（3）-（dodec-2-enyl）succinoyl/-derivatives[J]. Carbohydrate Polymers，2006，64（1）：66-72.

[8]Li Y C，Sun X J，Bi Y，et al. Antifungal activity of chitosan on fusarium sulphureum in relation to dry rot of potato tuber[J]. Agricultural Sciences in China，2009，8（5）：597-604.

[9]鄭連英，朱江峰，孫昆山. 殼聚糖的抗菌性能研究[J]. 材料科學(xué)與工程，2000，18（2）：22-24.

[10]Wang X H，Du Y M，F(xiàn)an L H，et al. Chitosan-metal complexes as antimicrobial agent：Synthesis，characterization and structure-activity study[J]. Polymer Bulletin，2005，55（1/2）：105-113.

[11]Wang X H，Du Y M，Liu H. Preparation，characterization and antimicrobial activity of chitosan-Zn complex[J]. Carbohydrate Polymers，2004，56：21-26.

[12]王 鴻，沈月新. 不同脫乙酰度殼聚糖的抑菌性[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，10（4）：380-382.endprint