唐金鳳，魯耀邦，胡文鏵，王永存，王思捷，楊 騰，吳 平*

（1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，廣東 湛江 524001；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；3.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理中心，廣東 湛江524001；4.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 524001）

miR-135b在鼻咽癌中的表達及其意義

唐金鳳1，魯耀邦2，胡文鏵3，王永存4，王思捷1，楊 騰1，吳 平1*

（1.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心，廣東 湛江 524001；2.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；3.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理中心，廣東 湛江524001；4.廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 524001）

目的 探討miR-135b在鼻咽癌（NPC）中的表達情況及與臨床病理特征的關(guān)系。方法 收集鼻咽患者活檢組織92例，其中NPC組織67例，鼻咽黏膜慢性炎癥(CIONM)組織25例。通過qPCR方法檢測miR-135b在NPC組織和CIONM組織中的相對差異表達，利用SPSS軟件統(tǒng)計分析miR-135b與NPC臨床病例特征的相關(guān)性。結(jié)果 （1）miR-135b在NPC組織中的表達量明顯高于CIONM組織(P＜0.01)；（2）miR-135b在不同性別中亦存在明顯差異，92例鼻咽患者和67例NPC患者中均存在男性的表達明顯高于女性(P＜0.01)；（3）miR-135b的表達與年齡有相關(guān)性(r=0.213，P＜0.05)；（4）miR-135b在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起重要作用，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中miR-135b的表達高于無淋巴結(jié)腫大的患者(P＜0.05)。結(jié)論 在NPC患者中miR-135b在年齡分組、性別分組及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移分組中均存在表達差異。miR-135b是NPC的危險因素，為后續(xù)探索NPC早期診斷的分子標記物提供理論基礎。

鼻咽癌；miR-135b；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；分子標記物

鼻咽癌（nasopharvnx cancer，NPC）是一種與EB病毒感染有關(guān)、多基因參與、遺傳與環(huán)境因素協(xié)同作用的惡性腫瘤，在我國兩廣、福建等地發(fā)病率較高，發(fā)病率及死亡率都存在性別和年齡的差異[1]。NPC以男性居多，男女發(fā)病率比平均為2.5∶1。從年齡上看，NPC的發(fā)病率在30歲開始迅速上升，50～59歲呈最高峰，60歲后逐漸穩(wěn)定[2-3]。目前，NPC的主要診斷方法有：電子鼻腔鏡檢查、影像學檢查和EB病毒血清學檢查[4-7]。電子鼻腔鏡是目前最主要的檢測方法，但是由于NPC早期癥狀不明顯，發(fā)病部位較隱蔽，特別是解剖部位在咽隱窩和鼻咽頂部者，鼻腔鏡檢查較容易漏診。鼻咽部結(jié)構(gòu)比較復雜，骨、軟骨、軟組織與淋巴結(jié)交錯，故影像學檢查也較容易誤診和漏診[4]。EB 病毒血清學檢測特異性相對較低，即便能夠確診的NPC也較多已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，錯過了最佳的治療時機[8]。因此，尋找一種理想的NPC早期診斷的分子標記物是目前提高 NPC診斷率、降低其死亡率的關(guān)鍵。本試驗在前期研究[9]的基礎上進一步分析miR-135b與性別、年齡、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床特征的相關(guān)性，為尋找NPC早期診斷分子標記物及發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院2013年4月至2013年7月NPC和鼻咽黏膜慢性炎癥 （chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa，CIONM）活檢組織標本，立即放于液氮中保存。所有組織標本活檢后均行免疫組化檢測經(jīng)病理學診斷證實，其中NPC組織67例，經(jīng)病理證實為低分化鱗狀細胞癌；CIONM組織25例。男73例，女性18例，年齡17～86歲，所有收集的病例主要來自廣東省。本研究遵循倫理學標準并得到本院倫理委員會批準及受試者的知情同意。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol（Invitrogen，美國）；+miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRcutemiRNAcDNA第一鏈合成試劑盒(KR201，TIANGEN，北京）；miRcutemiRNA熒光定量檢測試劑盒 (FP401，TIANGEN，北京)；has-miR-135b（CD201-0213，TIANGEN，北京)；U6(CD201-0145, TIANGEN，北京)；焦炭酸二乙酯DEPC(生工，上海）。

TANKPE060超純水系統(tǒng)（millipore，美國）；Biophotometer 6131核酸蛋白分析儀 （Invitrogen，美國）；Centrifuge 5418R冷凍高速離心機（eppendorf，德國）；LightCycle 480熒光定量 PCR儀（ROCHE，瑞士）。

1.3 qPCR檢測

1.3.1 總RNA提取 常規(guī)Trizol試劑抽提組織總RNA核酸蛋白分析儀測定RNA純度和濃度。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 按 miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 miR-cutemiRNAcDNA第一鏈合成試劑盒 (TIANGEN生物公司)說明書進行。

1.3.3 熒光定量PCR 采用熒光定量PCR儀進行定量PCR反應。按miRcutemiRNA熒光定量檢測試劑盒（TIANGEN公司）說明書進行，PCR反應條件如下：94℃預變性2 min；94℃變性20 sec、60℃延伸 34 sec，40個循環(huán)；60～90 ℃溶 解曲線 分析。miRNA的相對表達量通過公式2-△CT計算，其中U6作為內(nèi)標。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，每組實驗至少重復3次。根據(jù)臨床資料對年齡、性別、淋巴轉(zhuǎn)移進行分組。miR-135b的熒光定量PCR結(jié)果在鼻咽癌與鼻咽黏膜患者分組、性別分組及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移分組中，方程齊性時采用兩獨立樣本t檢驗，方差不齊時采用近似t檢驗；年齡分組中miR-135b的表達結(jié)果采用方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。鼻咽癌與miR-135b、性別、年齡的相關(guān)性分析采用Spearman雙側(cè)檢驗，miR-135b與年齡的相關(guān)性采用Pearson雙側(cè)檢驗，r≥0.8（P＜0.05）為強相關(guān)，0.8＞r≥0.4（P＜0.05）為相關(guān)。危險因素分析通過二元Logistic回歸及ROC曲線分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-135b在CIONM組織與NPC組織的表達情況

miR-135b在67例NPC組織中的表達量明顯高于25例CIONM組織，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明miR-135b在NPC組織中表達上調(diào)。見表1。

表1 miR-135b在CIONM組織與NPC組織中的表達情況（±s）

表1 miR-135b在CIONM組織與NPC組織中的表達情況（±s）

注：與CIONM組織比較**P＜0.01。

組織類型CIONM組織NPC組織n 25 67 miR-135b表達0.003 60±0.000 96 0.020 40±0.003 76**

2.2 miR-135b的表達在不同組織類別中與性別的相關(guān)性

在92例鼻咽患者中miR-135b在男性患者中的表達明顯高于女性患者（P＜0.01)，鼻咽患者男女比例約為3.84；在NPC患者中miR-135b在男性患者中的表達也高于女性患者 （P＜0.05)，NPC患者男女比例為5.7；而在CIONM組織中miR-135b不存在此類情況。見表2。

表2 miR-135b的表達在不同組織類型與性別的相關(guān)性（±s）

表2 miR-135b的表達在不同組織類型與性別的相關(guān)性（±s）

注：與同組織類別中男性組比較**P＜0.01，*P＜0.05。

組織類型NPC及CIONM組織（n=92）NPC組織（n=67) CIONM組織（n=25) n 性別73 19 57 10 16 9男 女 男 女 男女miR-135b表達0.016 7±0.003 2 0.006 4±0.001 9** 0.020 2±0.004 0 0.007 8±0.002 3* 0.004 4±0.001 4 0.002 2±0.000 4

2.3 NPC與年齡的相關(guān)性及miR-135b在NPC患者中的表達與年齡段關(guān)系

由統(tǒng)計結(jié)果可以看出CIONM患者的平均年齡在36歲左右，而NPC患者的平均年齡在50歲左右，其存在顯著性差異（P＜0.01)，結(jié)果提示NPC患者的年齡層次偏大。見表3。

在miR-135b的研究中我們以30歲、50歲及60歲為界限來分層，結(jié)果顯示，miR-135b的表達在30～49歲和50～59歲與小于30歲組別相比存在低表達差異（P＜0.05)，并且NPC患者在4個年齡組別的比例為7∶27∶13∶20。見圖1。

表3 NPC與年齡的相關(guān)性 （±s）

表3 NPC與年齡的相關(guān)性 （±s）

注：與CIONM組織比較**P＜0.01。

組織類型CIONM組織NPC組織n 25 67年齡（歲）36.63±2.41 50.34±1.73**

圖1 miR-135b在NPC組織中的表達與年齡段的相關(guān)性

2.4 NPC的風險因素分析

NPC與miR-135b、性別、年齡相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.485(P＜0.01)、r=-0.232(P＜0.05)、r=0.419 (P＜0.01)；miR-135b與年齡存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.213（P＜0.05）。通過ROC曲線分析，年齡和miR-135b均為NPC的危險因素，其95%置信區(qū)間分別為0.702～0.891、0.668～0.881。見圖2。

2.5 miR-135b與淋巴轉(zhuǎn)移分析

miR-135b在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達高于未淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05），說明 miR-135b在NPC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否中存在差異。見表4。

圖2 NPC風險因素的ROC曲線分析圖

表4 miR-135b與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 （±s）

表4 miR-135b與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性 （±s）

注：與未轉(zhuǎn)移患者比較*P＜0.05。

淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移未轉(zhuǎn)移患者轉(zhuǎn)移患者n 12 55 miR-135b表達0.009 0±0.001 1 0.015 4±0.002 8*

3 討論

microRNA（miRNA）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類長約20～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，具有調(diào)控功能并具有高度保守性、時序性和組織特異性。近年研究表明，miRNA參與各類調(diào)控途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、脂肪代謝等，還可作為類似癌基因和抑癌基因作用參與細胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的生物學作用[10-12]。目前已有研究表明miR-135b可影響淋巴瘤、腎癌、胃癌、結(jié)腸癌細胞的增殖，調(diào)控乳腺癌、肝癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[13-15]，另有報道[13]在非小細胞肺癌中miR-135b在高侵染組織中顯著高表達，過表達miR-135b能增加腫瘤的發(fā)生，而抑制miR-135b的表達能降低腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移，臨床還顯示肺癌患者中的高表達miR-135b能顯著降低總生存率。但miR-135b在NPC中相關(guān)的生物學作用研究尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)NPC中miR-135b的表達明顯高于CIONM組織，說明miR-135b在NPC中表現(xiàn)為致癌作用，并可能參與NPC的發(fā)生，在NPC診斷方面，NPC發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為臨床診斷中常用的一個治療方法參考標準。研究發(fā)現(xiàn)miR-135b的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中miR-135b的表達高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，此結(jié)果與miR-135b在非小細胞肺癌[13]中的作用相似，其具體作用機制及可否作為NPC診斷的一個分子靶標有待后續(xù)研究。NPC與其他癌癥相比發(fā)病率具有地域、性別、年齡差異等，但其發(fā)生的原因尚未有明確定論。在本研究中發(fā)現(xiàn)NPC患者中男女比例高達5.7，而miR-135b在男性和女性中的表達也存在差異性，在男性中的表達高于在女性中的表達，我們推測miR-135b可能參與調(diào)控NPC發(fā)病存在性別差異的過程。統(tǒng)計分析亦表明，年齡越大患NPC的可能性越高。以上結(jié)果表明：在NPC患者中miR-135b與其發(fā)生，及其性別、年齡、淋巴轉(zhuǎn)移等臨床特征具有明顯的相關(guān)性，且有望將miR-135b作為NPC早期診斷的分子標志物。

綜上所述，miR-135b對NPC的發(fā)生發(fā)展有重要的作用，為miRNA作為腫瘤的早期診斷提供了重要的理論依據(jù)。但其影響NPC患者在不同性別、年齡中發(fā)病率及淋巴轉(zhuǎn)移的作用機制還有待我們的后續(xù)研究。

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（本文編輯 匡靜之）

The Expression of miR-135b in Nasopharyngeal Carcinoma and its Significance

Jin-Feng Tang1,Yao-Bang Lu2,Wen-Hua Hu3,Yong-Cun Wang4,Si-Jie Wang1,Teng Yang1,Ping Wu1*
（1.Clinical Research Center,Affiliated Hospital of Guangdong Medical college,Zhanjiang,Guangdong 524001,China;
2.School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;3.Pathological Center, Affiliated Hospital of Guangdong Medical college,Zhanjiang,Guangdong 524001,China;4.Cancer Center,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang,Guangdong 524001,China）

Objective To investigate the expression ofmiR-135b and clinicopathologicalfeaturesofrelevance in nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods 92 cases of nasopharyngeal biopsies were collected,in which were 67 cases of NPC patients and 25 cases of Chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa(CIONM)patients.The expression of miR-135b relative differencesin NPC tissuesand NC tissueswere analyzed by qPCR methods.The correlation ofmiR-135b and nasopharyngeal characteristic was analyzed by using SPSS software.Results (1)The expression of miR-135b in NPC was significantly higher than CIONM (P＜0.01).(2)The expression of miR-135b was significant differences in gender,and 92 cases of nasopharyngeal biopsies and 67 cases of NPC male patients were higher than the female patients(P＜0.01).(3)The expression of miR-135b were correlated with age(r=0.213,P＜0.05).(4)MiR-135b plays an important role in lymph node metastasis,the expression levels of miR-135b in patients with lymph node metastasis was significantly higher than in patients without lymph node enlargement(P＜0.05).Conclusion The miR-135b in the age,gender and lymph node metastasisgroups were differentially expressed in NPC patients.The miR-135b that is a risk factor of NPC nasopharyngeal carcinoma provides a theoretical basis for further exploration of the early diagnosis of NPC molecular markers.

nasopharyngeal carcinoma;miR-135b;lymph node metastasis;molecular markers

R446.8

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2015.07.017

2015－04－09

廣東醫(yī)學院科研基金面上培育項目資助（M2014049）。

唐金鳳，女，實習研究員，碩士，主要從事腫瘤研究方向。

*吳 平，男，主任技師，碩士研究生導師，E-mail：wping62@126.com。