鄧培淵+郭紅玲+袁偉+李玉華

摘要：從粗提重組凝乳酶的得率、保存活性2個(gè)方面比較了乙醇沉淀法和硫酸銨沉淀法的差別。結(jié)果表明，相對(duì)于硫酸銨沉淀法，乙醇沉淀法獲得蛋白的量相差不是很大，但是乙醇沉淀法所獲得蛋白的單位效價(jià)是硫酸銨沉淀法的1.27倍，且乙醇沉淀法所得產(chǎn)物的比活性提高了16.78%。綜合考慮重組凝乳酶的得率與活性，用乙醇沉淀的效果較好。

關(guān)鍵詞：重組凝乳酶;活性;乙醇沉淀法;硫酸銨;鹽析

中圖分類號(hào)： Q814.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）04-0050-03

收稿日期：2014-05-08

基金項(xiàng)目：河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（編號(hào)：102300410146）。

作者簡(jiǎn)介：鄧培淵（1981—），男，河南登封人，博士，講師，主要從事動(dòng)物分子生物學(xué)研究。E-mail：zhzd201@hotmail.com。

凝乳酶原一般存在于反芻動(dòng)物的第4胃中，在酸性條件下經(jīng)自我剪切形成有活性的凝乳酶。凝乳酶屬于酸性蛋白酶，主要功能是水解Κ-酪蛋白的Phe 105-Met 106鍵，在室溫以上并有Ca2+存在時(shí)，可使蛋白質(zhì)凝聚成乳塊，因而在奶酪生產(chǎn)和改良中有重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。目前，凝乳酶的替代品主要來(lái)源于動(dòng)物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶以及重組凝乳酶。常見的動(dòng)物胃蛋白酶主要存在于幼豬[2]、小雞、金槍魚以及鯊魚中[3-5]，但是這些動(dòng)物的胃蛋白酶與小牛凝乳酶仍有所不同。在多種植物的不同部位中可以分離到使乳凝固的蛋白酶，即植物凝乳酶[6]。在合歡樹、無(wú)花果、新鮮木瓜中提取出的蛋白酶以及姜汁、檸檬汁等植物非蛋白酶均有較好的凝乳作用，因此具有廣闊的商業(yè)價(jià)值[7-10]。

微生物凝乳酶主要來(lái)源于細(xì)菌、放線菌和真菌，由于微生物凝乳酶具有耐熱性強(qiáng)、不易失活的特點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中需要進(jìn)一步調(diào)整工藝促使凝乳酶失活。研究發(fā)現(xiàn)，基因工程凝乳酶同天然凝乳酶的性質(zhì)基本相同，利用基因工程生產(chǎn)的凝乳酶不僅純度高、產(chǎn)出的奶酪品質(zhì)好，而且易于工業(yè)化生產(chǎn)，因此重組凝乳酶具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[11]。

要對(duì)外源表達(dá)的凝乳酶進(jìn)行分離純化，獲取有活性的目的產(chǎn)物，純化的第1步就是對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，在去除雜質(zhì)的同時(shí)，可以獲取高活性的凝乳酶。目前粗提外源表達(dá)凝乳酶常用硫酸銨沉淀法或乙醇沉淀法，不同的粗提方法直接影響凝乳酶的活性和純化效果。本研究對(duì)外源表達(dá)重組凝乳酶的初步濃縮方法進(jìn)行比較分析，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為重組菌株km2，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.2 培養(yǎng)基

100 mL YEPD培養(yǎng)基配方：1 g 酵母提取物，2 g 葡萄糖，2 g 蛋白胨，加去離子水至100 mL，于120 ℃滅菌30 min（固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加1.5%～2.0% 瓊脂）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 粗酶液制備 挑取單菌落轉(zhuǎn)接于YEPD固體培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)28 h后，挑取單菌落接種于50mL種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)20 h，以5%的接種量接種于95 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，再于28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)約96 h，冷凍離心（4 ℃、8 000 r/min、15 min）后取上清，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 硫酸銨沉淀法 取6組500 mL粗酶液，分別加入硫酸銨至飽和度分別為10%、20%、40%、60%、80%、100%，混勻后于4 ℃過(guò)夜，4 ℃、8 000 r/min離心15 min，棄上清，將沉淀溶于0.05 mol/L、pH值為6.2的磷酸鹽緩沖液中，即得粗酶液。測(cè)定重組凝乳酶活力及蛋白含量，計(jì)算回收率。

1.3.3 乙醇沉淀法 取500 mL粗酶液，按不同體積比分別緩慢加入預(yù)冷乙醇中，4 ℃沉淀過(guò)夜，8 000 r/min離心 15 min，棄上清，將沉淀溶于0.05 mol/L、pH值為6.2的磷酸鹽緩沖液中，得到粗酶液;4 ℃沉淀2 h，8 000 r/min離心 15 min，棄上清，將沉淀溶于0.05 mol/L、pH值為6.2的磷酸鹽緩沖液中，得到粗酶液。測(cè)定重組凝乳酶活力及蛋白含量，計(jì)算回收率。

1.3.4 重組凝乳酶原十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析表達(dá)產(chǎn)物 以發(fā)酵培養(yǎng)基作為參照物，將硫酸銨沉淀、乙醇沉淀所得的粗酶液通過(guò)SDS-PAGE（12%）電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物[12]。

1.3.5 凝乳酶活性測(cè)定方法 用1 mol/L H2SO4將粗酶液的pH值調(diào)整至2.0，室溫條件下放置2 h，然后用2 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）調(diào)上清液的pH值至6.0。采用Arima等的方法[12]進(jìn)行凝乳酶活力的測(cè)定，用0.01 mol/L CaCl2液配制10%脫脂乳，該溶液配制后在室溫放置40 min后使用，取2 mL 10%脫脂奶粉液于35 ℃保溫10 min。加1 mL稀釋的酶液（酶液于35 ℃保溫），搖勻并計(jì)時(shí)，觀察到管壁上開始出現(xiàn)凝乳顆粒為終點(diǎn)，記錄凝乳時(shí)間。在上述條件下，40 min凝結(jié)1 mL 10%脫脂奶粉的酶量定義為1個(gè)Soxhlet單位（SU）。

酶活力=供試乳數(shù)量÷凝乳酶量×D×2 400÷T。

式中：D為酶液稀釋倍數(shù);T為反應(yīng)時(shí)間，s。

凝乳酶回收率=沉淀液凝乳酶活性/粗酶液凝乳酶活性×100%。

1.3.6 凝乳酶蛋白含量測(cè)定方法 運(yùn)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定目的蛋白質(zhì)濃度。在堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562 nm處的吸光度值D562 nm，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。具體操作按照TaKaRa BCA Protein Assay Kit說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

確定合適的沉淀方法是提高外源表達(dá)凝乳酶得率的關(guān)鍵步驟，為此本研究比較了乙醇和硫酸銨沉淀法對(duì)重組菌株外源表達(dá)凝乳酶的粗提效果。

2.1 硫酸銨沉淀和乙醇沉淀所得粗產(chǎn)物的比較

由表1可以看出，乙醇沉淀法與硫酸銨沉淀法相比，獲得的蛋白總量相差不是很大，乙醇沉淀法的得率為40.31%，高于硫酸銨沉淀法的得率36.93%，是1種更加有效的沉淀方法。

表1 2種沉淀法所得重組凝乳酶中的蛋白含量

方法 樣品 蛋白濃度

（mg/mL） 總體積

（mL） 蛋白總量

（mg）

硫酸銨沉淀 上清液（處理前） 0.87 450 391.5

沉淀物 4.82 30 144.6

乙醇沉淀 上清液 0.87 450 391.5

沉淀物（處理前） 5.26 30 157.8

注：蛋白得率=沉淀物中蛋白總量/上清液蛋白總量×100%。

2.2 硫酸銨沉淀法和乙醇沉淀法粗產(chǎn)物活性的比較

活性評(píng)價(jià)是純化方法的1個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用Arima等的方法進(jìn)行凝乳酶活的測(cè)定，重復(fù)3次并取3次重復(fù)的平均值，結(jié)果如表2所示。

表2 2種沉淀方法的重組凝乳酶活性比較

樣品 蛋白濃度

（mg/mL） 蛋白總量

（mg） 酶活性

（AU） 比活性

（AU/mg） 效價(jià)

（AU/mL）

硫酸銨沉淀物 4.82 144.6 523.6 108.630 705 4 523.6

乙醇沉淀物 5.26 157.8 667.3 126.863 117 9 667.3

表2結(jié)果表明，乙醇沉淀法所得粗產(chǎn)物的單位效價(jià)是硫酸銨沉淀法的1.27倍，且乙醇沉淀法所得產(chǎn)物的比活性提高了16.78%?？梢钥闯觯靡掖汲恋矸梢员苊饬蛩徜@沉淀法所帶來(lái)的鹽離子濃度高的影響，減少后續(xù)的純化工藝，是1種針對(duì)外源表達(dá)凝乳酶較理想的沉淀方法。

2.3 不同飽和度硫酸銨及乙醇對(duì)重組凝乳酶分離效果的影響

重組凝乳酶在胞外分泌表達(dá)中有許多蛋白分泌到胞外。去除雜蛋白是確定酶活性穩(wěn)定的要素。選用不同飽和度硫酸銨鹽析或乙醇沉淀發(fā)酵液，考察它們對(duì)重組凝乳酶回收率的影響，結(jié)果如圖1 所示。

圖1表明，不同飽和度硫酸銨對(duì)重組凝乳酶回收率影響較大。硫酸銨飽和度在20%～30%范圍內(nèi)時(shí)，回收率變化不大;隨著硫酸銨飽和度增加，酶活回收率呈增大趨勢(shì)， 在80%

時(shí)重組凝乳酶活性回收率最高，達(dá)到86%;飽和度大于80%時(shí)，酶活回收率迅速降低。

由圖2可知，在發(fā)酵液中乙醇含量在20%以內(nèi)時(shí)，回收率變化不大;在20%～50%范圍內(nèi)，隨著乙醇含量增加，回收率逐漸提高;在50%時(shí)，回收率約為84%;超過(guò)50%時(shí)，酶活回收率下降。

2.4 SDS-PAGE電泳分析比較硫酸銨和乙醇沉淀法

將重組菌株km2在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h后所得上清液用硫酸銨和乙醇沉淀并稀釋后，得到蛋白質(zhì)溶液，用pH值為2.0的HCl進(jìn)行酸化處理，通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

圖3表明，經(jīng)過(guò)酸化處理后，重組凝乳酶的蛋白分子量約36 ku。與發(fā)酵上清液相比，乙醇法沉淀物和硫酸銨法沉淀物均得到一定的濃縮，乙醇法沉淀后所得的蛋白含量略高于硫酸銨法沉淀。

3 結(jié)論

硫酸銨沉淀法是利用在高離子強(qiáng)度的溶液中，通過(guò)增加蛋白質(zhì)的疏水作用，使得蛋白質(zhì)趨于聚集，達(dá)到溶解極限使蛋白沉淀析出的目的。硫酸銨的性質(zhì)比較溫和，不容易引起蛋白的失活，能夠較大程度地保持蛋白的活性，是運(yùn)用最廣泛的沉淀方法[13]。利用基因重組法獲得總蛋白沉淀后需要經(jīng)純化才能得到目的蛋白，硫酸銨法沉淀過(guò)程中引入鹽離子，鹽析次數(shù)多[14]，導(dǎo)致后續(xù)蛋白純化時(shí)增加了去鹽步驟，從而加大了目的蛋白的損失率，因此，乙醇沉淀法更適合基因工程產(chǎn)物的沉淀。

本研究利用乙醇沉淀法提取重組凝乳酶胞外表達(dá)產(chǎn)物，相對(duì)于硫酸銨沉淀法能夠更加有效地從發(fā)酵液中沉淀蛋白。以500 mL發(fā)酵液為例，利用乙醇沉淀法比硫酸銨沉淀法的得率提高了3.38百分點(diǎn)，得到的重組凝乳酶粗產(chǎn)物的比活性提高了16.78%?？梢娨掖汲恋矸ê?jiǎn)便高效，是1種針對(duì)重組凝乳酶粗提的合適、有效的沉淀方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]Visser S. Proteolytic enzymes and their relation to cheese ripening and flavor： an overview[J]. Journal of Dairy Science，1993，76（1）：329-350.

[2]劉文宗，蔣 敏，何曉霞，等. 干酪凝乳酶代用品研究[J]. 四川畜牧獸醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，15（2）：23-27.

[3]Tavares J F，Baptista J A，Marcone M F. Milk-coagulating enzymes of tuna fish waste as a rennet substitute[J]. International Journal of Food Sciences and Nutrition，1997，48（3）：169-176.

[4]苑艷輝. 水產(chǎn)品下腳料綜合利用研究之進(jìn)展[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2004，31（1）：44-48.

[5]Haard N F. A review of proteotlytic enzymes from marine organisms and their application in the food industry[J]. Journal of Aquatic Food Product Technology，1992，1（1）：17-35.

[6]顧瑞霞，申 戈. 凝乳酶及其代用品[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，1991（1）：20-23.

[7]薛彥斌. 樹木凝乳酶的研究與應(yīng)用[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，1990（3）：130-132.

[8]張富新，楊寶進(jìn). 植物凝乳酶凝乳特性的研究[J]. 黃牛雜志，1997（1）：27-29.

[9]宋 云，李立釗，崔雅潔，等. 不同因素對(duì)凝乳酸活力的影響[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，1995，23（3）：124-128.

[10]張富新，田呈瑞. 木瓜蛋白酶凝乳特性的研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，25（2）：111-114.

[11]高維東，甘伯中，丁福軍，等. 微生物凝乳酶的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)乳品工業(yè)，2009，37（5）：34-36，47.

[12]Arima K，Yu J，Iwasaki S. Methods in enzymology[M]. New York and London：Academic Press，1970：446-459.

[13]Saavedra L，Castellano P， Sesma F. Purification of bacteriocins produced by lactic acid bacteria[J]. Methods Mol Biol， 2004，268：331-336.

[14]Siegelman H W， Kycia J H. Algal biliproteins： handbook of phycological method[M]. Cambridge： Cambridge University Press，1978：71-79.