劉欣偉，柳云恩，張玉彪，周大鵬，趙 勇，項(xiàng)良碧，侯明曉

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院骨科，遼寧沈陽 110016;2沈陽軍區(qū)總醫(yī)院全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110016

褪黑素對脊髓的保護(hù)作用逐漸被認(rèn)識[1-4]，有學(xué)者通過在大鼠神經(jīng)損傷后即刻施加褪黑素干預(yù)來觀察其對脊髓損傷的保護(hù)作用并研究其機(jī)制。然而，在臨床工作中卻經(jīng)常會(huì)遇到一些無法在第一時(shí)間來院進(jìn)行治療的神經(jīng)損傷患者，對于這部分進(jìn)行神經(jīng)損傷延遲修復(fù)的患者，褪黑素的保護(hù)作用報(bào)道較少。本研究通過Masson染色及免疫組織化學(xué)方法觀察褪黑素對大鼠坐骨神經(jīng)損傷延遲修復(fù)后的神經(jīng)保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠48只，體重205～235 g。由沈陽化工學(xué)院新藥安全評價(jià)中心動(dòng)物部提供[許可證號:SYXK(遼)2006-0002]。

1.1.2 試劑及儀器 褪黑素(Melatonin，MT)，免疫組化染色試劑盒及一抗多克隆抗體(北京索來寶公司)。水合氯醛、無水乙醇及其他溶劑由沈陽軍區(qū)總醫(yī)院藥學(xué)部提供。低溫冰箱(日本三洋公司)、電子天平及干燥箱(上海民橋科學(xué)精密儀器公司)、冰凍切片機(jī)(德國萊卡公司)、光學(xué)及倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、離心機(jī)(德國西格瑪公司)、Image Pro Plus圖像分析軟件(美國GE公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建模和分組 將48只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組:延遲1 d修復(fù)組(n=12)、延遲1周修復(fù)組(n=12)、延遲1個(gè)月修復(fù)組(n=12)和延遲2個(gè)月修復(fù)組(n=12)。分別在坐骨神經(jīng)橫斷性損傷后1 d、1周、1個(gè)月及2個(gè)月后進(jìn)行縫合修復(fù)。每組大鼠又隨機(jī)分為:實(shí)驗(yàn)組(n=6)和對照組(n=6)。實(shí)驗(yàn)組大鼠在神經(jīng)修復(fù)完成后立即給予褪黑素100 mg/kg溶于無水乙醇溶劑中，行腹腔注射，而對照組大鼠不給予褪黑素。

1.2.2 手術(shù)步驟 大鼠以水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后備皮，鉗夾皮膚沒有明顯痛覺反應(yīng)后，顯露任意一側(cè)坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)分叉點(diǎn)近端1 cm處，使用鋒利刀片將坐骨神經(jīng)切斷。在制作神經(jīng)損傷延遲修復(fù)模型中，為防止神經(jīng)離斷后近端神經(jīng)自行長入遠(yuǎn)端，將近端神經(jīng)埋入鄰近肌肉中，使用10-0縫線縫合肌肉和神經(jīng)。術(shù)畢，放入籠中飼養(yǎng)。各組大鼠分別在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)(1 d、1周、1個(gè)月、2個(gè)月)予以褪黑素藥物干預(yù)，然后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。5 d后處死大鼠，取斷端、近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)，放入液氮或4%多聚甲醛中等待后續(xù)處理。

1.2.3 Masson染色 取術(shù)后5 d的神經(jīng)標(biāo)本制作石蠟切片。然后脫蠟至蒸餾水;Weigert鐵蘇木精染色5～10 min，蒸餾水稍沖洗;鹽酸乙醇分化液分化，蒸餾水沖洗數(shù)分鐘;稀氨水溶液返藍(lán)15 s，蒸餾水稍洗;麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水稍沖洗;1% 冰醋酸處理1 min;95%乙醇脫水多次;無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.4 免疫組織化學(xué) 取術(shù)后5 d的神經(jīng)標(biāo)本制作石蠟切片，切面與神經(jīng)走行平行。然后脫蠟至蒸餾水。3%H2O2孵育10 min。PBS洗2～3遍后進(jìn)行抗原修復(fù)。普通山羊血清封閉15 min，傾干后滴加兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)多抗(1：50)，4 ℃ 下孵育過夜。PBS洗3遍，滴加適量生物素標(biāo)記工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗2～3遍后，加入辣根過氧化物酶聯(lián)羊抗兔IgG二抗孵育15 min。PBS洗3遍，DAB常溫下顯色5 min。PBS洗10 min后，蘇木精復(fù)染2 min，蒸餾水沖洗10～15 min。脫水，透明，封片，鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 給予褪黑素5 d后觀察，4組大鼠無論是否給予褪黑素，都存在不同程度的足踝下垂以及行動(dòng)不便。這種現(xiàn)象可能與恢復(fù)時(shí)間較短有關(guān)。

2.2 Masson染色 在延遲1 d修復(fù)組和延遲1周修復(fù)組中，對照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)尚未發(fā)生組織崩解，幾近正常組織學(xué)形態(tài)，排列緊密，互相平行，軸突連續(xù)，軸突周圍圍繞著一層厚厚的淡紅色髓鞘，施萬細(xì)胞核深紅褐色，形態(tài)正常，神經(jīng)膜呈藍(lán)色。而在延遲1個(gè)月修復(fù)組和延遲2個(gè)月修復(fù)組中，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)不存在，嚴(yán)重紊亂，大量變性、脫失的髓鞘以及大量溶解或裂解的施萬細(xì)胞核呈碎片狀。除此之外，膠原纖維大量充斥在崩解的神經(jīng)纖維組織之間，并且隨著延遲修復(fù)時(shí)間的延長，膠原纖維的比例越來越多，發(fā)生華勒氏變性的神經(jīng)細(xì)胞以及失神經(jīng)接觸的施萬細(xì)胞散落在膠原纖維之間。見圖1。

圖1 術(shù)后5 d各組大鼠坐骨神經(jīng)Masson染色

2.3 TGF-β抗體免疫組織化學(xué)染色 隨著延遲修復(fù)時(shí)間的延長，無論實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M，TGF-β抗體染色陽性細(xì)胞數(shù)越來越密，提示隨著延遲修復(fù)時(shí)間的延長，成纖維細(xì)胞不斷浸潤遠(yuǎn)端神經(jīng)。該結(jié)果與Masson染色的結(jié)果一致，在神經(jīng)離斷后短期內(nèi)，成纖維細(xì)胞浸潤較少，膠原纖維的表達(dá)和合成較少。隨著時(shí)間的延長，組織中的成纖維細(xì)胞越來越多，因此，神經(jīng)組織中出現(xiàn)大量的膠原纖維。見圖2。

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn)，周圍神經(jīng)損傷后不僅會(huì)發(fā)生生理變化，而且往往伴隨著病理和細(xì)胞代謝的改變[5-8]。神經(jīng)生長速度緩慢，神經(jīng)斷端以遠(yuǎn)的施萬細(xì)胞對再生神經(jīng)的支持隨著失神經(jīng)支配時(shí)間的延長會(huì)越來越弱。大鼠的坐骨神經(jīng)纖維需要大約1個(gè)月才能全部生長通過神經(jīng)縫合處[9-10]。學(xué)者們研究了褪黑素對神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)褪黑素對大鼠的神經(jīng)損傷有明顯的保護(hù)作用，可以縮短軸突再生通過斷端的時(shí)間，利于神經(jīng)損傷的修復(fù)。

然而，這些實(shí)驗(yàn)大多是在建立神經(jīng)損傷模型后立即給予褪黑素[11-12]。在臨床實(shí)際工作中，會(huì)有一部分患者由于各種條件限制，無法在受傷后第一時(shí)間就診，較早的手術(shù)治療在傷后12 h內(nèi)[13]，這對患者神經(jīng)損傷治療的預(yù)后造成了不利影響。本研究在前期實(shí)驗(yàn)中觀察到坐骨神經(jīng)損傷后延遲修復(fù)時(shí)，褪黑素促進(jìn)神經(jīng)再生不是持續(xù)有效的，褪黑素的有效期限為神經(jīng)損傷后1個(gè)月以內(nèi)。本研究中設(shè)計(jì)了神經(jīng)損傷延遲修復(fù)的藥物干預(yù)動(dòng)物模型，以觀察褪黑素在這種情況下對坐骨神經(jīng)的保護(hù)作用。4組動(dòng)物分別在神經(jīng)損傷后1 d、1周、1個(gè)月和2個(gè)月后給予修復(fù)。實(shí)驗(yàn)組給予了褪黑素藥物干預(yù)，術(shù)后5 d觀察到所有動(dòng)物術(shù)側(cè)后肢都存在不同程度的跛行現(xiàn)象，分析其原因可能與恢復(fù)時(shí)間較短有關(guān)。

圖2 各組大鼠坐骨神經(jīng)TGF-β抗體免疫組織化學(xué)染色

Masson染色和TGF-β抗體的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示，在延遲1 d和延遲1周修復(fù)組，無論是對照組還是實(shí)驗(yàn)組，Masson染色中膠原纖維面積比例都不超過20%，隨著神經(jīng)損傷后修復(fù)時(shí)間的延遲，膠原纖維面積逐漸增大。在延遲1 d修復(fù)組和延遲1周修復(fù)組中，神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)尚存在，髓鞘飽滿，而膠原纖維很少;TGF-β染色的成纖維細(xì)胞的浸潤也相對較少。而從延遲1個(gè)月修復(fù)組開始，可以發(fā)現(xiàn)神經(jīng)完全崩解，連續(xù)的神經(jīng)結(jié)構(gòu)被散落存在的施萬細(xì)胞以及膠原纖維所代替，TGF-β染色的成纖維細(xì)胞的密度較前兩組高。由于TGF-β可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化，刺激多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等活性物質(zhì)的合成和分泌及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生。因此，在組織纖維化中起重要作用，是目前已知的可以誘導(dǎo)多種組織纖維化的最具代表性的一種細(xì)胞因子[14-15]。在延遲1個(gè)月和延遲2個(gè)月修復(fù)組中，TGF-β免疫組織化學(xué)染色明顯強(qiáng)于延遲1 d和延遲1周修復(fù)組，表明隨著修復(fù)時(shí)間的延長，神經(jīng)遠(yuǎn)端組織的纖維化程度明顯加重。這個(gè)現(xiàn)象提示，周圍神經(jīng)損傷1個(gè)月后，組織退變及神經(jīng)遠(yuǎn)端組織的纖維化是神經(jīng)延遲修復(fù)后褪黑素不再能夠促進(jìn)神經(jīng)再生的原因之一。

綜上所述，本研究認(rèn)為，褪黑素對坐骨神經(jīng)損傷存在一定的保護(hù)作用，坐骨神經(jīng)損傷后延遲修復(fù)的時(shí)間對于褪黑素對坐骨神經(jīng)損傷的保護(hù)作用存在影響。

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