鄒文燾 劉廣鵬

β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）是目前較為常用的骨組織工程支架材料，具有良好的生物相容性[1]和可降解性，構(gòu)建的組織工程骨有望成為臨床修復(fù)骨缺損的新方法[2-3]。組織工程骨的體外構(gòu)建過程中常應(yīng)用胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）作為細胞培養(yǎng)介質(zhì)，而β-TCP的多孔支架結(jié)構(gòu)易于吸附異種蛋白成分，因而會對組織工程骨臨床應(yīng)用的生物安全性造成影響。本文擬從β-TCP構(gòu)建的組織工程骨牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）殘余量的角度進行研究，為評價組織工程骨生物安全性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

磷酸三鈣 （β-TCP）（上海組織工程研究與開發(fā)中心研制）；牛血清白蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒（無錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM 低糖培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國）；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、EDTA、地塞米松、β-磷酸甘油鈉和維生素C（Sigma公司，美國）。

Beckman XL90低溫離心機 （Beckman公司，德國）；TC-100B恒溫水平搖床（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）；Bio-Rad iMark 酶標(biāo)儀（Bio-Rad 公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs分離培養(yǎng)

按文獻[4-5]的方法，從正常人骨髓中分離純化BMSCs，按1×106cells/cm2有核細胞的密度接種培養(yǎng)皿，加入含有10%胎牛血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后首次換液，以后隔日換液。原代細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)擴增至第2代細胞，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 組織工程骨的體外構(gòu)建

以 β-TCP 為支架材料（4 mm×4 mm×4 mm），環(huán)氧乙烷消毒后置于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。取第2代hBMSCs，以1×106cells/mL的密度接種于β-TCP。每塊材料接種10 μL細胞懸液，細胞數(shù)量為1×104個。將細胞材料復(fù)合物置于細胞培養(yǎng)箱4 h后，轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板，每孔加200 μL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（含低糖DMEM，10%FBS，10-8mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油鈉和 10-4mol/L維生素C），37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，于檢測前1 d更換為無血清的條件培養(yǎng)液，制備成待檢測的組織工程骨樣品。對照組為未接種細胞的β-TCP，同樣置于200 μL成骨條件培養(yǎng)液中2周，檢測前1 d更換為無血清的條件培養(yǎng)液。

1.2.3 酶聯(lián)免疫分析法測定BSA含量

應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析法測定標(biāo)本中BSA含量。首先用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體。包被單抗的微孔中加入BSA抗原，經(jīng)過結(jié)合、洗滌后加入酶標(biāo)抗BSA抗體，洗滌后用顯色劑顯色。顏色的深淺和樣品中的BSA呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品BSA濃度。

1.2.4 待測樣品準(zhǔn)備

1.2.4.1 細胞洗滌液的準(zhǔn)備

第2代hBMSCs長滿培養(yǎng)皿底部后常規(guī)消化，1 500 r/min離心5 min，棄去液體，細胞計數(shù)。添加10 mL PBS，重懸細胞，離心，收集PBS液體。再重復(fù)2次，獲得3次細胞洗滌液待測。

1.2.4.2 組織工程骨樣品的準(zhǔn)備

取組織工程骨樣品，以體積比1∶100的37℃生理鹽水浸泡并洗滌3次，每次10 min，然后將樣品置于濾紙上吸附殘余液體，剪碎，稱重，置于1.5 mL的Eppendorf管中。根據(jù) 《醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于試驗材料浸提液的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[6]，每0.2 g樣品加1 mL PBS平放固定于搖床，37℃、150 r/min振蕩浸提24 h。對照組樣品同法處理獲取浸提液。每例樣品吸取0.3 mL浸提液待測。另將組織工程骨樣品3次浸泡沖洗后的生理鹽水也分別取樣待測。

1.2.5 BSA殘余量測定

96孔酶標(biāo)板（試劑盒自備）分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔（復(fù)孔數(shù)均為2）。每孔分別加標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測樣品50 μL。輕輕混勻，37℃密封溫育60 min。將酶標(biāo)板取出棄去液體，甩干，每個孔中加洗滌液300~350 μL，反應(yīng)30 sec后甩去液體，在濾紙上將酶標(biāo)板拍干。重復(fù)此步驟3次。在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入100 μL的酶標(biāo)多抗溶液，20℃~25℃避光孵育30 min。洗板4次，拍干。依序每孔加底物溶液50 μL，20℃~25℃避光顯色 10~15 min。 依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)。10 min內(nèi)酶標(biāo)儀450 nm波長測量各孔的光密度（OD值）。

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，用Microsoft Excel統(tǒng)計軟件計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，算出樣品實際濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用Microsoft Excel統(tǒng)計軟件，通過t檢驗對組織工程骨和單純β-TCP材料的BSA殘余量進行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計結(jié)果以s表示，P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 hBMSCs的分離、純化、培養(yǎng)和傳代

待測細胞為正常人第2代BMSCs（圖1），長滿培養(yǎng)皿底部時的細胞數(shù)量約為1.5~2×106個。

2.2 組織工程骨的體外構(gòu)建

顯微CT和掃描電鏡觀察可見β-TCP呈相互貫通的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔徑為300~500 μm，孔隙率為（92.6±1.1）%。hBMSCs接種 β-TCP 后，體外繼續(xù)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，掃描電鏡檢測顯示材料表面可見細胞分泌較多細胞外基質(zhì)（圖2）。

2.3 細胞洗滌液中BSA濃度

BSA檢測試劑盒檢測范圍為0~40 ng/mL，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9832，符合試劑盒規(guī)定的R2>0.97的標(biāo)準(zhǔn)檢測要求。

細胞洗滌液 BSA 濃度為（712.49±111.40）ng/mL、（38.69±26.20）ng/mL 和 （2.32±1.78）ng/mL，3 次結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，n=3，圖 3）。

2.4 組織工程骨洗滌液BSA濃度

組織工程骨洗滌液中BSA含量，隨洗滌次數(shù)增多而明顯降低。3次洗滌液的BSA濃度分別為（305.86±93.41）ng/mL、（39.19±8.26）ng/mL 和（6.43±1.57）ng/mL，3 次結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，n=10，圖 4）。

2.5 組織工程骨BSA殘余量測定

實驗組平均干重為（26.02±5.07）mg，對照組為（21.59±6.69）mg，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，n=10，圖5）。實驗組平均BSA殘余量為 （19.54±6.70）ng，單位重量的 BSA 殘余量為（0.656±0.213）ng/mg。 對照組的相應(yīng)值分別為 （15.67±5.49）ng和（0.796±0.205）ng/mg， 兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P>0.05，n=10，圖 6）。

圖1 BMSCs形態(tài)觀察Fig.1 Histological observation of BMSCs

圖2 β-TCP支架材料大體觀及鏡下觀Fig.2 General observation and microscopic observation of β-TCP scaffold material

圖3 細胞洗滌液BSA含量Fig.3 BSA content of in the dilution liquid of BMSCs

圖4 組織工程骨洗滌液BSA含量Fig.4 BSA content of in the dilution liquid of tissue engineered bone

圖5 每塊樣品BSA殘余量Fig.5 The average residual BSA in tissue engineered bone

圖6 單位重量樣品BSA殘余量Fig.6 The normalized residual BSA in tissue engineered bone

3 討論

組織工程骨在構(gòu)建過程中，其種子細胞的培養(yǎng)多需添加胎牛血清（FBS）；在細胞與支架材料的復(fù)合過程中，也需要FBS作為介質(zhì)，提供細胞營養(yǎng)，維持細胞活性。生物支架材料的三維多孔性結(jié)構(gòu)使材料內(nèi)表面積增大，有利于細胞的黏附和生長，為細胞基質(zhì)分泌與合成提供良好的外環(huán)境，又便于營養(yǎng)成分的運輸及代謝產(chǎn)物的排出[7-8]。但同時也容易吸附培養(yǎng)液中的BSA等異種蛋白。BSA作為牛血清中含量最高的蛋白質(zhì)成分，能夠?qū)е聶C體產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。因此，BSA殘余量的多少關(guān)系到組織工程產(chǎn)品的安全性。

《中華人民共和國藥典》（2010版三部）規(guī)定，人體疫苗的BSA殘余量按酶聯(lián)免疫方法進行檢測，每件不超過50 ng[9]。目前，組織工程骨的國家標(biāo)準(zhǔn)尚未建立，相關(guān)的研究報道較少。本實驗應(yīng)用ELISA法檢測常規(guī)消化后的細胞洗滌液中的BSA含量。結(jié)果表明，BMSCs洗滌液中BSA濃度隨著洗滌次數(shù)的增加而明顯降低；經(jīng)過3次洗滌后，細胞洗滌液中的BSA殘余量能夠降至藥典規(guī)定的BSA殘余量上限。

進一步的實驗顯示，以β-TCP為支架的組織工程骨樣品的BSA殘余量平均值為19.54 ng。若修復(fù)骨缺損的材料體積為2 cm3，其規(guī)格大小對于臨床應(yīng)用而言并不是很大，但相應(yīng)的BSA殘余量將達到610.62 ng，這將遠遠超出藥典的規(guī)定限量。而接種BMSCs的組織工程骨與未接種細胞的β-TCP材料相比，兩者單位重量的BSA殘余量無顯著性差異，表明支架材料較種子細胞更為容易吸附殘留BSA。

本實驗表明，在種子細胞體外培養(yǎng)階段，所使用的血清成分易于通過離心洗滌的方法予以去除；而當(dāng)細胞與支架材料進行復(fù)合之后，由于支架材料會大量吸附培養(yǎng)基中的血清成分，此時難以再將血清從支架中分離出來。理想的清洗流程應(yīng)在綜合考慮最大限度清除殘留BSA，并最大限度保留產(chǎn)品生物學(xué)活性之間取得平衡，以兼顧產(chǎn)品的安全性和有效性，這方面的研究目前尚未引起足夠重視[10]。

[1]Wiedmann-Al-Ahmad M,Gutwald R,Gellrich NC,et al.Growth of human osteoblast-like cells on beta-tricalciumphosphate(TCP)membranes with different structures[J].J Mater Sci Mater Med,2007,18(4):551-563.

[2]Szpalski C,Wetterau M,Barr J,et al.Bone tissue engineering:current strategies and techniques--part I:Scaffolds[J].Tissue Eng Part B Rev,2012,18(4):246-257.

[3]Panseri S,Russo A,Cunha C,et al.Osteochondral tissue engineering approaches for articular cartilage and subchondral bone regeneration[J].Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc,2012,20(6):1182-1191.

[4]劉廣鵬,趙莉,劉波,等.新型β-磷酸三鈣的制備與成骨能力的實驗研究[J].中華創(chuàng)傷骨科雜志,2006,8(8):755-759.

[5]劉廣鵬,趙莉,袁捷,等.多孔β-磷酸三鈣陶瓷表面處理前后的成骨能力比較[J].中國口腔頜面外科雜志,2006,4(3):202-206.

[6]國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.GB/T 16886.12-2000醫(yī)療器械生物學(xué)評價—第12部分:樣品的制備與參照樣品[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2000.

[7]Gurin AN,Komlev VS,Fadeeva IV,et al.A comparative study of bone regeneration potency of alfa and beta-tricalcium phosphate bone substitute materials[J].Stomatologiia,2012,91(6):16-21.

[8]Fong EL,Watson BM,Kasper FK,et al.Building bridges:leveraging interdisciplinary collaborations in the development of biomaterials to meet clinical needs[J].Adv Mater,2012,24(36):4995-5013.

[9]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[10]方玉,馮曉明,奚廷斐.組織工程醫(yī)療產(chǎn)品中殘留牛血清白蛋白的檢驗常見問題[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(32):6347-6350.