王柯尹 楊乃彬 倪順蘭 謝新生 余 曉 盧明芹

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SOCSs在慢加急性肝衰竭大鼠肝組織中的表達(dá)變化及意義

王柯尹 楊乃彬 倪順蘭 謝新生 余 曉 盧明芹

目的 探討細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(suppressors of eytokine signaling,SOCSs)在慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure，ACLF)大鼠肝組織中的表達(dá)及其在ACLF發(fā)生中的作用。方法 健康SD大鼠隨機(jī)分組，ACLF組大鼠腹腔注射1.5ml/kg的50%四氯化碳花生油溶液，每3天1次，10次后改為2ml/kg，每3天1次，9次后給予250mg/kg D-氨基半乳糖(D-GalN)聯(lián)合50μg/kg脂多糖(LPS)急性攻擊，給藥后0、6、12、24h 留取大鼠血及肝組織。血生化檢測(cè)ALT、AST水平和ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6水平。HE染色下觀察肝臟病理學(xué)變化。RT-PCR檢測(cè)大鼠肝組織SOCS-1、SOCS-3mRNA表達(dá)。結(jié)果 大鼠慢加急性肝衰竭模型復(fù)制成功，ACLF組血清ALT和AST水平逐漸上升，在12h升高最明顯，血清TNF-α、IL-6水平在造模后0h 即明顯高于對(duì)照組,至6h達(dá)峰值(P<0.05)，肝組織SOCS-1、SOCS-3mRNA水平于造模后0h開始升高，12h升高最為顯著，之后逐漸下降，與正常對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 SOCSs在慢加急性肝衰竭過程中升高，其變化與TNF-α、IL-6改變相關(guān)，提示SOCSs可能參與慢加急性肝衰竭中的炎癥及免疫調(diào)節(jié)過程。

慢加急性肝衰竭 細(xì)胞因子 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子

慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病基礎(chǔ)及急性損傷因素作用下出現(xiàn)的肝功能急劇惡化，表現(xiàn)為黃疸、腹腔積液、凝血功能障礙、肝性腦病等，預(yù)后差，病死率高[1]。其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，涉及感染、炎性反應(yīng)、免疫損傷、器官衰竭等，其中TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子在肝臟免疫和炎性反應(yīng)中起重要作用，可直接參與引起肝細(xì)胞的壞死，加重肝衰竭病變過程[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/sigal transduction and activators of transcription,JAK/STAT)通路是細(xì)胞因子發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與機(jī)體炎性反應(yīng)，免疫調(diào)節(jié)及細(xì)胞損傷、凋亡等過程[3]。SOCSs是一種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子，對(duì)JAK-STA途徑進(jìn)行負(fù)反饋抑制，在維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)等起著重要作用，近年研究表明，SOCSs表達(dá)上調(diào)可能與肝細(xì)胞損傷炎性過程相關(guān)。本研究通過檢測(cè)慢加急性肝衰竭大鼠各時(shí)間點(diǎn)肝組織SOCS-l、SOCS-3mRNA和血清TNF-α、IL-6表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，探討SOCSs在ACLF臨床轉(zhuǎn)歸中的作用。

材料與方法

1.試驗(yàn)動(dòng)物:清潔級(jí)SD大鼠30只，雄性，體重180～200g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)前1周領(lǐng)取動(dòng)物，分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，室溫約23℃，間隔12h照明。

2.試劑：四氯化碳購自天津博迪股份有限公司；D-GalN購自南通通呂生物制品有限公司；LPS購自上海閃晶生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒由大連寶生物公司提供；TNF-α、IL-6試劑盒購自美國Genzyme公司。

3.方法:(1)動(dòng)物模型建立與分組:清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，實(shí)驗(yàn)前1日下午禁食，飲水不限，隨機(jī)分為:慢加急性肝衰竭組(ACLF組，n=24): 腹腔注射1.5ml/kg的50%四氯化碳花生油溶液，每3天1次，注射10次后改為2ml/kg，每3天1次，共9次。D-GalN溶于無菌生理鹽水，配成10%的溶液，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，給予250mg/kg D-GaIN聯(lián)合50μg/kg LPS急性攻擊，分別于給藥后0、6、12、24h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，每次處死6只。正常對(duì)照組(n=6):腹腔注射同等劑量花生油。(2)取標(biāo)本:以10%水合氯醛麻醉，采集大鼠門靜脈血，離心10min后留取上清液，存放-80℃冰箱供檢測(cè)使用。(3)肝組織病理檢查：肝組織標(biāo)本用100ml/L甲醛固定，逐級(jí)乙醇脫水，石蠟包埋，制備切片，經(jīng)HE染色光鏡下觀察病理變化。(4)肝功能檢測(cè)：采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST水平。(5)血清TNF-α、IL-6測(cè)定:按試劑盒說明書采用ElISA法檢測(cè)。(6)RT-PCR法檢測(cè)肝組織SOCS-1、SOCS-3mRNA表達(dá):肝組織勻漿，Trizol法提取肝組織總RNA，用紫外線分光光度儀測(cè)定吸光度后計(jì)算樣本A260/A280比值，介于1.8～2.0的用于反轉(zhuǎn)錄，取樣本PCR產(chǎn)物5μl和溴酚藍(lán)緩沖液1μl混勻，取標(biāo)志物2.5μl作相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠穩(wěn)壓電泳(100V 27min)，采用凝膠圖像系統(tǒng)，用Gel-Pro3.1軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描，以SOCS-1、SOCS-3與β-actin吸光度比值作為目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，引物由上海捷瑞公司合成。SOCS-1 PCR反應(yīng)條件:95℃ 5min，95℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 17s，35個(gè)循環(huán)；4℃ 3min。內(nèi)參β-actin PCR反應(yīng)條件: 95℃ 5min，95℃ 30s，58.4℃ 30s，72℃ 6s，35個(gè)循環(huán)；4℃ 5min。SOCS-3 PCR反應(yīng)條件:95℃ 5min，95℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 27s，35個(gè)循環(huán)；4℃ 3min。內(nèi)參β-actin PCR反應(yīng)條件: 95℃ 5min，95℃ 30s，58.4℃ 30s，72℃ 6s，35個(gè)循環(huán)；4℃ 5min。序列見表1。

結(jié) 果

1. 一般情況:對(duì)照組大鼠反應(yīng)靈敏，攝食飲水量多，模型組0h開始活動(dòng)、進(jìn)食減少，6h精神萎靡，動(dòng)作遲緩，對(duì)刺激反應(yīng)減弱，12h后逐漸出現(xiàn)呼吸氣促、肢體發(fā)抖、口鼻出血。

表1 PCR引物序列

2.血清學(xué)變化:ACLF組血清ALT和AST在造模后很快上升，12h達(dá)高峰，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ALT：F=71.937，286.218，456.977，297.659，P<0.05；AST：F=68.050，195.495，440.675，664.438，P<0.05，表2)。ACLF組大鼠血清TNF-α、IL-6均在造模后0h即有所上升，至6h達(dá)峰值，之后逐漸下降，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(TNF-α:F=367.468,463.177,874.417,283.401,P<0.05；IL-6:F=757.885,803.649,698.713,477.883,(P<0．05),詳見表2。

表2 各組大鼠血清ALT、AST、TNF-α、IL-6檢測(cè)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，P<0.05

3.肝臟形態(tài)、病理學(xué)變化：正常對(duì)照組大鼠肝臟呈鮮紅色，形態(tài)正常，表面光滑，病理顯示肝小葉結(jié)構(gòu)完整，未見肝細(xì)胞變性、壞死。實(shí)驗(yàn)組肝臟體積縮小，表明呈細(xì)顆?；蚪Y(jié)節(jié)狀，病理示顯示纖維組織增生，同時(shí)存在壞死、凋亡及再生肝細(xì)胞，再生肝細(xì)胞排列紊亂，形成肝內(nèi)假小葉，伴有肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)，存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。6h時(shí)可見大量肝細(xì)胞壞死，炎性浸潤(rùn)及出血明顯，肝竇或間質(zhì)內(nèi)見出血灶。12h后顯示肝細(xì)胞大片壞死、凋亡，壞死區(qū)及匯管區(qū)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇明顯擴(kuò)張充血，殘存肝細(xì)胞可見水腫、嗜酸性變(圖1)。

4.肝組織SOCS-1、SOCS-3mRNA表達(dá)：正常大鼠肝組織中存在少量SOCS-1、SOCS-3mRNA表達(dá)，ACLF組SOCS-1、SOCS-3mRNA表達(dá)均于造模后立即開始逐漸增加，12h達(dá)到高峰，24h開始下降，與正常對(duì)照組(0.718±0.102) 各時(shí)間點(diǎn)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SOCS-1:F=28.734，80.533，409.701，220.445，P<0.05；SOCS-3:F=40.433，101.544，319.141，191.229，P<0.05，圖2，表3)。

圖1 大鼠肝組織HE染色(×200)A.正常對(duì)照組；B.ACLF組0h；C.ACLF組6h；D.ACLF組12h

討 論

圖2 RT-PCR法檢測(cè)肝組織SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)水平1.正常對(duì)照組；2.0h；3.6h；4.12h；5.24h；M.標(biāo)志物；β-actin.β-肌動(dòng)蛋白

表3 各組肝組織SOCS-1、SOCS-3 mRNA表達(dá)(與β-actin灰度比值，

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

慢加急性肝衰竭是一種病因復(fù)雜、治療困難的疾病，目前認(rèn)為免疫系統(tǒng)過度激活介導(dǎo)局部炎性反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞因子的大量分泌是造成其病理損害的中心環(huán)節(jié)。肝衰竭時(shí)循環(huán)中高水平的內(nèi)毒素可激活庫普弗細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等多種炎性介質(zhì)， 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡，啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成組織缺血缺氧甚至多器官衰竭。Mao等[4]發(fā)現(xiàn)ACLF患者肝內(nèi)TNF-α表達(dá)較慢乙肝患者明顯升高。Elsing等[5]在慢加急性肝衰竭中大鼠肝組織中檢測(cè)到高濃度的TNF-α、IL-6浸潤(rùn)，提示TNF-α、IL-6等促炎因子可能導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死或凋亡，抑制肝細(xì)胞再生，參與肝臟炎性損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，慢加急性肝衰竭大鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高，提示TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子可能通過引發(fā)多種化學(xué)介質(zhì)釋放，創(chuàng)建一個(gè)促炎性的周圍環(huán)境，加重組織損傷，促進(jìn)肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展。

研究表明，當(dāng)細(xì)胞因子作用于靶細(xì)胞表面受體，需要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，才能啟動(dòng)靶細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的生理效應(yīng)，其中JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一條重要途徑，它通過TNF-α與細(xì)胞膜上的INFAR-I綁定形成二聚體，激活細(xì)胞質(zhì)中Jak-1和Tyk2，使STAT1和STAT2磷酸化，參與細(xì)胞凋亡、致炎因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控等多種生物學(xué)過程[6，7]。SOCS-1、SOCS-3屬于SOCS家族，目前已經(jīng)被認(rèn)為是強(qiáng)有力的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子，可介導(dǎo)SH2和KIR功能區(qū)與JAKs直接結(jié)合抑制其酪氨酸激酶活性，對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路進(jìn)行負(fù)調(diào)控[8，9]。有報(bào)道顯示SOCS蛋白參與T細(xì)胞的分化和調(diào)控，在天然免疫和獲得性免疫中扮演重要角色，與炎癥和免疫反應(yīng)密切相關(guān)[10]。研究證實(shí)，JAK/STAT信號(hào)通路在肝臟炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子可有效刺激STAT活化，誘導(dǎo)目的基因表達(dá)[11～13]。另一方面，SOCSs可對(duì)STAT信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，抑制上述細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，推測(cè)SOCSs參與了對(duì)肝細(xì)胞炎性反應(yīng)的特異性調(diào)控，與慢加急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展之間存在著某些聯(lián)系，但具體聯(lián)系到目前為止尚不十分明確[14]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ACLF組大鼠血清血清TNF-α、IL-6水平在造模后0h開始升高，6h達(dá)高峰，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，ACLF組SOCS-1、SOCS-3 mRNA于造模后即高于對(duì)照組，12h達(dá)峰值，之后逐漸下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這提示SOCSsmRNA的表達(dá)水平隨著肝臟損傷程度加重而增加，肝損害越明顯，SOCSs表達(dá)越多，但略晚于TNF-α、IL-6表達(dá)，考慮發(fā)生肝衰竭時(shí)，大量肝細(xì)胞損傷，TNF-α、IL-6等炎性因子釋放，與相應(yīng)的受體結(jié)合導(dǎo)致JAKs 的激活，激活的JAKs將受體上特定的酪氨酸殘基磷酸化，誘導(dǎo)STATs活化，進(jìn)一步刺激SOCSs mRNA表達(dá)上調(diào)。筆者的研究結(jié)果顯示，造模12h后肝組織TNF-α和IL-6表達(dá)水平下降,可能與SOCSs 通過阻止訪問信號(hào)傳感器、抑制STAT受體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄等方式對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行負(fù)反饋環(huán)調(diào)節(jié)有關(guān)[15]。據(jù)此推測(cè),在慢加急性肝衰竭發(fā)生、發(fā)展中，SOCSs表達(dá)水平的改變與TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子的變化密切相關(guān)，影響慢加急性肝衰竭整個(gè)病理生理過程，但目前國內(nèi)外關(guān)于SOCSs在慢加急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中的影響報(bào)道較少，因此，仍有待于通過更深一步研究?jī)烧咧g的具體關(guān)系，從而減輕甚至阻止各種因素對(duì)肝臟造成的破壞,為發(fā)現(xiàn)慢加急性肝衰竭治療手段開拓新的領(lǐng)域。

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(修回日期：2015-02-12)

Expression of SOCSs in Rats with Acute-on-chronic Liver Failure and Its Significance.

WangKeyin，YangNaibin，NiShunlan，etal.

DepartmentofInfectionDisease，TheFirstHospitalofJiaxing，Zhejiang314000，China

Objective To investigate the expression of SOCSs in liver tissues of rats with acute on chronic liver failure(ACLF) and the function of SOCSs in ACLF. Methods The SD male rats were randomly divided into two groups. Rats in ACLF group were intraperitoneally injected with: 1.5ml/kg of 50% carbon tetrachloride peanut oil solution, every 3 days for the first month; 2ml/kg of 50% carbon tetrachloride peanut oil solution, every 3 days for another two months; then 250mg/kg D-GalN and 50μg/kg LPS at once. Rats in normal group were intraperitoneally injected with 0.9% NaCl solution. Liver tissue and blood were collected on 0,6,12,24hours after the final injection. The level of ALT、AST were detected by automatic biochemical analyzer and TNF-α,IL-6 were determined by ELISA. The liver pathologic changes were observed with HE staining by microscope. SOCS-1,SOCS-3mRNA of liver tissues were determined by RT-PCR. Results ACLF model of rats were successfully built. The level of ALT and AST in model group peaked at 12 hours. The level of TNF-α,IL-6 were obviously higher than those in control group and peaked at 6h(P<0.05). SOCS-1,SOCS-3mRNA began to rise after modeling，peaked at 12h and decreased gradually. Compared with the normal group, difference in all time point were statistically significant(P<0.05). Conclusion The level of SOCSs in ACLF group were upregulated and the upregulation was associated with IFN-α,IL-6, suggesting that SOCSs may participate in the process of inflammation and immune regulation in ACLF.

Acute-on-chronic liver failure；Cytokines；Suppressors of cytokine signalings

314000 嘉興市第一醫(yī)院感染科(王柯尹、謝新生、余曉)；325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科(楊乃彬、倪順蘭、盧明芹)

盧明芹，電子信箱:LMQ0906@163.com

R575

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.030

2015-01-21)