廖衛(wèi)滔 肖 佳 鄭 剛 夏鴻彬 何成宜 周少朋 陳志英

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人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞增殖性及凋亡的影響

廖衛(wèi)滔 肖 佳 鄭 剛 夏鴻彬 何成宜 周少朋 陳志英

目的 探討人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchyma cell, MSC)對(duì)肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為HCC的治療提供新的思路。方法 取50%覆蓋率的MSC培養(yǎng)皿，換上新鮮的DMEM/F-12培養(yǎng)基，待其培養(yǎng)至100%的覆蓋率后收集培養(yǎng)基備用，即為MSC條件培養(yǎng)基。用新鮮DMEM/F-12培養(yǎng)基加上等量的MSC條件培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2人類(lèi)肝癌細(xì)胞株24、48和72h，使用MTT法測(cè)定HepG2細(xì)胞的增殖活性、通過(guò)Hoechest33342和PI雙染色后在熒光倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)以測(cè)定HepG2細(xì)胞的凋亡、用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和黏附實(shí)驗(yàn)測(cè)定HepG2細(xì)胞侵襲能力以及通過(guò)Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果 混合培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24h后，對(duì)其生長(zhǎng)和凋亡及侵襲黏附能力沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。但是培養(yǎng)延長(zhǎng)到48h和72h后，HepG2細(xì)胞的活性、增殖能力、侵襲能力和黏附能力都受到顯著的抑制，這些變化伴隨著細(xì)胞分裂相關(guān)因子Ki-67、PCNA和組蛋白H3磷酸化水平下調(diào)，以及細(xì)胞凋亡執(zhí)行者caspase-3的激活和抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制。結(jié)論 體外間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有抑制肝臟腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡的作用。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 肝癌 增殖 凋亡 侵襲

肝癌是全世界常見(jiàn)的惡性腫瘤，它可分為原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌，而肝癌又以原發(fā)性肝癌中的肝細(xì)胞肝癌(HCC)最為常見(jiàn)。手術(shù)切除是目前根治原發(fā)性肝癌的首選治療手段，因?yàn)樵l(fā)性肝癌手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率很高，所以術(shù)后一般輔以放化療治療。肝移植是根治原發(fā)性肝癌的有效方法，但是目前肝臟來(lái)源過(guò)少、費(fèi)用高以及免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題存在阻礙肝移植的廣泛開(kāi)展。

近年來(lái)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)被廣泛用于腫瘤方面的研究，Studeny等[1]發(fā)現(xiàn)供體MSC主要在腫瘤部位聚集。Beckermann等[2]發(fā)現(xiàn)MSC主要在胰腺癌腫瘤組織中聚集。MSC的這一特性現(xiàn)在被稱(chēng)為腫瘤趨向性(tumor tropism)。很多研究表明當(dāng)MSC在腫瘤組織聚集并與腫瘤細(xì)胞接觸后，它可能通過(guò)以下機(jī)制發(fā)揮抑制腫瘤的效應(yīng)：①在白血病模型中，MSC通過(guò)分泌dickkopf-1(DKK-1)蛋白反向調(diào)控Wnt通路抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3]；②在卡波西肉瘤模型中，研究者發(fā)現(xiàn)MSC通過(guò)抑制PI3K/Akt 通路阻止腫瘤細(xì)胞的增殖[4]；③另外一系列體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSC不單可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，也可以促進(jìn)其凋亡。Qiao等[5]發(fā)現(xiàn)在有MSC存在的情況下，肝癌細(xì)胞c-myc、Bcl-2和PCNA的表達(dá)水平均呈下降趨勢(shì)，導(dǎo)致增殖活性降低，凋亡水平增加。MSC還可以誘導(dǎo)并提高細(xì)胞周期抑制蛋白p21的活性，使得腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期[6]。在一項(xiàng)大鼠HCC模型研究中發(fā)現(xiàn)注射MSC直接抑制腫瘤組織的生長(zhǎng)，改善了肝臟組織表觀和功能[7]。本研究將著重探討來(lái)源于人類(lèi)臍帶的MSC對(duì)于肝癌細(xì)胞系HepG2的增殖及凋亡的影響。

材料與方法

1.材料：(1)HepG2細(xì)胞:購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。HepG2細(xì)胞是使用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基并放置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。DMEM/F-12完全培養(yǎng)基是在DMEM/F12培養(yǎng)基溶液中加入10%的FBS，1%的雙抗(100×)配制而成。(2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的分離和培養(yǎng)：人臍帶由深圳市南山醫(yī)院提供；臍帶是按倫理要求經(jīng)過(guò)家屬填寫(xiě)《捐贈(zèng)同意書(shū)》后獲得。分離后首先浸泡在0.9%的NaCl溶液中，分離間充質(zhì)組織并離心。隨后在含1mg/ml的Ⅰ型膠原酶和雙抗的HBSS緩沖液中培養(yǎng)消化24h。完成后在DMEM/F-12培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)。(3)試劑：DMEM/F-12完全培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司的中國(guó)代理上海玉博生物科技有限公司；胎牛血清和雙抗(青霉素和鏈霉素)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司的中國(guó)代理上海玉博生物科技有限公司；MTT、PI(碘化丙啶)、Hoechest 33342購(gòu)自上海碧云天公司；Ki67(鼠抗)、PCNA(鼠抗)、Survivin(兔抗)、Bcl-2(兔抗)和caspase-3抗體(兔抗)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司中國(guó)代理上海川翔生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司中國(guó)代理上海拜力生物科技有限公司； transwell遷移實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞24孔培養(yǎng)板、BD Matrigel、結(jié)晶紫染液購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司；細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)所需纖維連接蛋白購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；組蛋白H3磷酸化ELISA試劑盒購(gòu)自艾美捷科技有限公司；4%多聚甲醛固定液購(gòu)自廣州市行知生物科技有限公司；DAPI購(gòu)自上海市上海魯汶生物科技有限公司。

2.HepG2細(xì)胞和hUCMSCs的培養(yǎng)：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)時(shí)均是使用DMEM/F-12完全培養(yǎng)基(加入10%胎牛血清)并放置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3.條件培養(yǎng)基的收集：當(dāng)hUCMSCs培養(yǎng)至50%覆蓋率時(shí)，換上新鮮的DMEM/F-12培養(yǎng)基，待其培養(yǎng)至100%的密度后收集該培養(yǎng)基即為MSC條件培養(yǎng)基。

4.hUCMSCs與HepG2的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)人類(lèi)肝癌細(xì)胞系HepG2至60%密度，然后將其培養(yǎng)基換成新鮮DMEM/F-12培養(yǎng)基加上等量的MSC條件培養(yǎng)基的混合培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24、48和72h。在該3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)收取細(xì)胞進(jìn)行生物化學(xué)和分子生物學(xué)分析。

5.細(xì)胞活性測(cè)定：共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)完成后，在培養(yǎng)基中加入終濃度為0.5mg/ml的MTT，然后將細(xì)胞放至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。之后在每孔內(nèi)加入1ml DMSO進(jìn)行溶解、混勻，吸取150μl至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，在酶標(biāo)儀上以570nm波長(zhǎng)讀板。

6.細(xì)胞凋亡比例測(cè)定：共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)完成后，在每孔內(nèi)加入5μg/ml的Hoechest 33342和5μg/ml的PI,混勻后放至細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20min，然后在熒光倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

7.Ki-67免疫組化測(cè)定：共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)完成后，按照常規(guī)方法進(jìn)行Ki-67的熒光免疫組化染色，使用5μg/ml的Hoechest 33342進(jìn)行復(fù)染，在熒光倒置顯微鏡下觀察。

8.癌細(xì)胞體外侵襲能力測(cè)定：制備好Matrigel的transwell 培養(yǎng)板后，在培養(yǎng)板下室加入500μl 條件培養(yǎng)基，上室種植密度為1×105個(gè)/毫升的HepG2細(xì)胞200μl、37℃、5% CO2分別培養(yǎng)24、48和72h。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取出后PBS洗2遍，用棉球擦去上室表面細(xì)胞，4℃甲醇固定15min；再用PBS洗2遍，DAPI染色1min室溫下染色1min后熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。侵襲抑制率(%) =(1-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100%。

9.癌細(xì)胞體外黏附實(shí)驗(yàn)：HepG2細(xì)胞首先使用無(wú)血清的DMEM(包含0.2%胰酶抑制物)清洗1遍，然后重懸于培養(yǎng)基中。隨后吸取100μl重懸細(xì)胞加入已經(jīng)包被有10μg/ml 纖維連接蛋白的96孔板中，用1μg/ml的BSA封閉。該板在37℃培養(yǎng)指定時(shí)間后，用PBS洗去未黏附的細(xì)胞，然后用MTT測(cè)定已經(jīng)黏附的細(xì)胞比例。

10. Western blot法檢測(cè)：共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)完成后，提取每孔細(xì)胞總蛋白，經(jīng)過(guò)定量后進(jìn)行常規(guī)Western blot法檢測(cè)增殖和凋亡相關(guān)通路蛋白表達(dá)量的變化。

11.組蛋白H3磷酸化檢測(cè)：組蛋白H3磷酸化的水平是衡量細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)之一。筆者利用不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞總蛋白進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，測(cè)量各組細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3磷酸化的水平。

12.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：每個(gè)處理時(shí)間組為4個(gè)重復(fù)。結(jié)果采用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用方差分析，兩兩比較時(shí)采用SNK法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果：使用MSC條件培養(yǎng)基處理HepG2細(xì)胞24h后，處理組的細(xì)胞活性(106.5%±1.0%)明顯高于對(duì)照組(100.0%±1.0%)(P=0.000)。但是，處理48h后，實(shí)驗(yàn)組(88.9%±1.2%)明顯低于對(duì)照組(100.0%±1.0%)(P=0.000)；72h后實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性進(jìn)一步下降(80.6%±1.0%)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(100.0%±1.0%)(P=0.000，圖1A)。

2.凋亡比例測(cè)定結(jié)果：使用MSC條件培養(yǎng)基處理HepG2細(xì)胞24h后，處理組與對(duì)照組凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)；培養(yǎng)48h和72h后，處理組的凋亡率都明顯高于對(duì)照組(圖1B)。

圖1 細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果

3.癌細(xì)胞侵襲和黏附能力測(cè)定：體外侵襲和黏附能力是癌細(xì)胞成瘤性的重要指標(biāo)。筆者發(fā)現(xiàn)，24h的MSC條件培養(yǎng)基處理對(duì)于HepG2的侵襲能力沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。但是，隨著處理時(shí)間的增加，48h和72h處理組的侵襲能力相比起對(duì)照組顯著下降，提示MSC條件培養(yǎng)基可以有效抑制HepG2的轉(zhuǎn)移能力(圖2)。此外，24h的MSC條件培養(yǎng)基處理對(duì)于HepG2的黏附能力只有少量的影響。但是當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到48或者72h后，MSC條件培養(yǎng)基處理顯著降低了HepG2的體外黏附水平(P=0.000，圖3)。

4.細(xì)胞增殖通路測(cè)定：為了檢測(cè)影響HepG2細(xì)胞增殖的分子標(biāo)志物，筆者進(jìn)行了Ki-67蛋白的免疫組化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，24hMSC條件培養(yǎng)基處理HepG2細(xì)胞并未造成細(xì)胞內(nèi)Ki-67表達(dá)量的明顯下降。和細(xì)胞活性的結(jié)果一樣，48和72h處理組的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)Ki-67表達(dá)量相較于對(duì)照組出現(xiàn)了顯著的下降(P=0.000)，提示MSC條件培養(yǎng)基可能通過(guò)下調(diào)胞內(nèi)Ki-67的表達(dá)影響HepG2的活性。另外細(xì)胞內(nèi)組蛋白H3的磷酸化水平的變化也進(jìn)一步驗(yàn)證了Ki-67的定量結(jié)果(圖4)。

圖2 凋亡比例測(cè)定結(jié)果

圖3 癌細(xì)胞侵襲和黏附能力測(cè)定

圖4 細(xì)胞增殖通路測(cè)定

5.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路測(cè)定：為了進(jìn)一步研究MSC條件培養(yǎng)基引起HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯和凋亡的影響，筆者在兩條通路中各挑選了兩個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行蛋白表達(dá)變化的分析。在48和72h這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，MSC條件培養(yǎng)基的處理大幅降低了細(xì)胞增殖關(guān)鍵蛋白PCNA和survivin的表達(dá)量，但是大幅增加了細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物——激活的caspase-3的表達(dá)量。此外，細(xì)胞內(nèi)抗凋亡標(biāo)志蛋白Bcl-2的表達(dá)水平被MSC條件培養(yǎng)基處理顯著抑制(圖5)。

圖5 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路測(cè)定

討 論

干細(xì)胞能否治療終末肝臟疾病(如肝硬化和肝癌)是當(dāng)前再生醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。已有的報(bào)道指出，雖然MSC對(duì)于急性肝損傷有較明顯的保護(hù)作用，但是其很難填補(bǔ)和再生已經(jīng)纖維化(或硬化)的肝臟組織。對(duì)于肝癌，有關(guān)MSC進(jìn)行臨床治療的研究報(bào)道不多。不同的研究表明，MSC對(duì)HCC和其他腫瘤有不同，有時(shí)甚至是截然相反的作用。在HCC中，一般認(rèn)為MSC既能抑制也可以促進(jìn)HCC的病理發(fā)生[8]。而新的研究認(rèn)為，骨髓MSC主要促進(jìn)部分腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[9]。究其原因，很可能不同來(lái)源的MSC分泌不同的細(xì)胞因子和其他信號(hào)分子發(fā)揮旁分泌的作用，而不同的腫瘤的表面表達(dá)不同的受體，從而表現(xiàn)出復(fù)雜的生理和病理結(jié)果[10]。所以進(jìn)一步了解各種MSC與不同腫瘤相互作用的分子機(jī)制，找出適合的MSC-特異腫瘤的配對(duì)，能夠幫助在臨床治療中誘導(dǎo)有效的腫瘤抑制作用而避免促進(jìn)作用。

在本研究中，筆者通過(guò)體外間接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)過(guò)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基可以起到抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和黏附，并促進(jìn)其凋亡的作用，表明人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可能具有抑制腫瘤生長(zhǎng)和其成瘤性的作用。這種作用是具有時(shí)間特異性的，即處理24h之內(nèi)未見(jiàn)明顯的抑制效果，需要將處理時(shí)間延長(zhǎng)至48h或72h后才能發(fā)揮作用。同時(shí)，筆者還分析了MSC條件培養(yǎng)基發(fā)揮這些作用的分子層面的影響。首先，MSC條件培養(yǎng)基通過(guò)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Ki-67、PCNA和組蛋白H3的磷酸化的水平抑制HepG2的增殖。其次，通過(guò)激活caspase-3和抑制Bcl-2來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有抑制肝臟腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的作用。值得注意的是，MSC由50%密度增殖到100%密度的時(shí)間較短(常規(guī)培養(yǎng)條件24～36h便可完成)。在如此短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基就能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞的成瘤性，說(shuō)明MSC在生長(zhǎng)過(guò)程中很有可能快速分泌一些抑癌物質(zhì)。近期研究發(fā)現(xiàn)，DKK-1可能是MSC分泌的最重要的抗腫瘤分子之一[11]。DKK-1是Wnt通路的直接抑制分子，直接作用的主要受體Wnt通路細(xì)胞膜上的受體之一——LRP6。除了白血病，亦有報(bào)道指出MSC分泌的DKK-1可以通過(guò)抑制Wnt通路減緩乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。鑒于MSC還可以分泌一些促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的旁分泌因子，例如白介素6等，MSC在動(dòng)物模型和臨床研究中對(duì)于HCC生長(zhǎng)的分子影響機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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(修回日期：2015-02-13)

Effects of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cell on the Proliferation of Apoptosis of Hepatoma Cells.

LiaoWeitao,XiaoJia,ZhengGang,etal.

LaboratoryforGeneandCellTherapy,ShenzhenInstituteofAdvancedTechnology,ChineseAcademyofSciences,Guangdong518055,China

Objective To examine the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell (MSC) on the proliferation of apoptosis of hepatoma cells and to provide novel therapeutic strategy for liver cancer. Methods Culture of MSC with 50% confluence was replaced with fresh DMEM/F-12 medium. When the confluence reached 100%, all culture used DMEM/F-12 was considered as the conditioning medium. This kind of medium was mixed with fresh DMEM/F-12 at 1∶1 to treat human hepatoma cell line HepG2for 24, 48 and 72 hours. Cellual viability was measured by MTT assay, apoptosis was quantified by Hoechst33342/PI co-staining, cell invasion ability and adhesion ability were measured by transwell assay and in vitro adhesion assay, respectively. Change of key signaling components were studied by Western blot. Results Conditioning medium showed no significant impact on the proliferation, apoptosis and invasion of HepG2after 24-hour incubation (P> 0.05). However, when treatment during was extended to 48 and 72 hours, the proliferation and invasion were significantly inhibited by the conditioning medium while cellular apoptosis was invoked. These were accompanied by the down-regulation of Ki-67, PCNA and histone H3 phosphorylation. Cleaved caspase-3 was increased while the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was inhibited. Conclusion Human umbilical cord mesenchymal stem cell was capable of inhibiting proliferation and invasion, as well as promoting apoptosis of human hepatoma cells in vitro.

Human umbilical cord mesenchymal stem cell；Liver cancer；Proliferation； Apoptosis;；Invasion

518055 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院基因和細(xì)胞治療技術(shù)研究室(廖衛(wèi)滔、鄭剛、夏鴻彬、何成宜、陳志英)；519000 珠海，中山大學(xué)附屬第五人民醫(yī)院麻醉科(廖衛(wèi)滔、周少朋)；510632 廣州，暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院免疫生物學(xué)系(肖佳)

周少朋，電子信箱: zsp005@163.com；陳志英，電子信箱: zy.chen1@siat.ac.cn

R735

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.026

2015-02-09)