路佩瑤，曹寧賢，王福傳，宋獻(xiàn)藝，張 凱

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所，太原 030031；2.山西省畜禽繁育工作站，太原 030001）

反芻動(dòng)物排放的甲烷是飼料在瘤胃內(nèi)發(fā)酵所產(chǎn)生的，是一種高能物質(zhì)。甲烷的生成是反芻動(dòng)物維持其瘤胃微生態(tài)平衡的有效機(jī)制。甲烷主要在反芻動(dòng)物瘤胃和后腸道內(nèi)產(chǎn)生，是甲烷菌利用氫、二氧化碳和乙酸等物質(zhì)為底物經(jīng)過(guò)酶促反應(yīng)后的產(chǎn)物。甲烷菌主要游離于瘤胃液或吸附在原蟲(chóng)表面以及胞液內(nèi)，其利用纖維分解菌產(chǎn)生的氫等底物合成甲烷，并主要以噯氣的形式排出體外，這對(duì)降低瘤胃內(nèi)的氫分壓起著重要作用，因此甲烷菌與其他微生物緊密聯(lián)系共同維持著瘤胃內(nèi)穩(wěn)定的微生態(tài)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1]。

研究表明，甲烷所消耗的能量約占飼料可消化能的6%～12%，低質(zhì)粗飼料可達(dá)15%，也就是說(shuō)反芻動(dòng)物在消化過(guò)程中有20%能量轉(zhuǎn)化成甲烷浪費(fèi)掉。瘤胃中甲烷的產(chǎn)生既造成能量損失，又加劇溫室效應(yīng)，然而其對(duì)反芻動(dòng)物是有益的。如何在降低甲烷生成的同時(shí)又不影響動(dòng)物的健康和生產(chǎn)性能，達(dá)到環(huán)境和經(jīng)濟(jì)的雙重效益，是目前研究的重點(diǎn)。

研究證明，通過(guò)添加硝酸鹽改變電子受體，使電子流向甲烷生成菌之外的微生物，促進(jìn)硝酸鹽還原菌在瘤胃內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育，使這些還原菌與甲烷生成菌競(jìng)爭(zhēng)氫原子而達(dá)到抑制甲烷產(chǎn)生的目的[2]。但是當(dāng)瘤胃中硝酸鹽添加過(guò)量時(shí)，硝酸鹽可被還原生成亞硝酸鹽，有可能引起亞硝酸鹽中毒，而且硝酸鹽本身還是很強(qiáng)的血管收縮劑，另外大量的硝酸鹽會(huì)降低反芻動(dòng)物的采食量[3]。因此，本試驗(yàn)采用體外產(chǎn)氣量法，研究瘤胃微生物適應(yīng)硝酸鹽前后，添加不同劑量硝酸鹽對(duì)瘤胃干物質(zhì)消化率的影響，探討是否可以通過(guò)逐漸飼喂的方法使瘤胃微生物適應(yīng)硝酸鹽，且不影響瘤胃對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)

試驗(yàn)動(dòng)物由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料獸藥研究所養(yǎng)殖基地提供。選用健康的、裝有永久性瘤胃瘺管的晉中羯羊6只為試驗(yàn)動(dòng)物。隨機(jī)分為2組，對(duì)照組綿羊不飼喂硝酸鹽，以尿素加豆粕為氮源，作為研究瘤胃微生物未適應(yīng)硝酸鹽時(shí)的瘤胃液供體動(dòng)物。試驗(yàn)組綿羊用KNO3逐漸代替尿素氮，直到KNO3的喂量達(dá)到日糧干物質(zhì)的2.27%，待動(dòng)物適應(yīng)硝酸鹽1周后，作為研究瘤胃微生物適應(yīng)硝酸鹽時(shí)的瘤胃液供體動(dòng)物。

1.2 試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧

試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧精粗飼料比例為30∶70，精飼料為混合精飼料，粗飼料為羊草。每天7:00和19:00飼喂兩次，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 活體外人工瘤胃產(chǎn)氣量試驗(yàn)

活體外人工瘤胃產(chǎn)氣量試驗(yàn)參照Menke等建立的體外產(chǎn)氣法進(jìn)行[4]。該法測(cè)得的200mg飼料干物質(zhì)24 h產(chǎn)氣量與綿羊活體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)消化率之間具有高度正相關(guān)[5]。試驗(yàn)底物以可溶性淀粉和纖維素為碳源，添加量分別為0.16和0.24 g；以KNO3作為唯一氮源，添加量分別為0.0032、0.0064和0.0134 g（NO3-N的含量分別為0.25%、0.50%和2.0%），將不同添加量的KNO3均勻地混入400mg底物中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，并設(shè)3個(gè)空白對(duì)照。晨飼前分別采集A組和B組瘤胃內(nèi)容物，分別用4層紗布過(guò)濾，過(guò)濾后的瘤胃液與緩沖液配制為1∶2的混合培養(yǎng)液。將60 mL混合培養(yǎng)液加入到預(yù)熱的盛有底物的培養(yǎng)瓶中39℃培養(yǎng)。

1.3.1 體外培養(yǎng)緩沖液的配制

試驗(yàn)所用緩沖液按照Russell和Jeraci方法配制[6]。

微量元素溶液（A）：每100 mL蒸餾水中含Ca?Cl2·2H2O 13.2 g、MnCl2· 4H2O 10 g、CoCl· 6H2O 1.0 g、FeCl3· 6H2O 8.0 g。

緩沖溶液（B）：將NH4HCO34.0 g和NaHCO335.0 g溶于蒸餾水，最后定容至1000 mL。

常量元素溶液（C）：Na2HPO45.7 g、K2HPO46.2 g、MgSO4·7H2O 0.6 g溶于蒸餾水，最后定容至1000 mL。

刃天青溶液：濃度為0.1%的刃天青溶液（m/V，厭氧指示劑，煮沸后有游離氧存在時(shí)呈紅色，無(wú)氧時(shí)呈無(wú)色）。

還原液溶液：NaOH 160mg和Na2S·9H2O 625mg溶于100 mL蒸餾水（使用時(shí)臨時(shí)配制）。

1.3.2 人工瘤胃營(yíng)養(yǎng)液的準(zhǔn)備

按照上述順序和比例配制瘤胃微生物緩沖液：蒸餾水400 mL+溶液A 0.1 mL+溶液B 200 mL+溶液C 200 mL+刃天青溶液1 mL+還原劑溶液40 mL，加入刃天青溶液后混合液變?yōu)榧t色，通入無(wú)氧CO2并預(yù)熱至39℃后約30 min，混合液顏色變淡或無(wú)色。在與過(guò)濾瘤胃液混合之前加入還原劑并通CO2氣體使溶液褪至完全無(wú)色。

1.3.3 人工瘤胃培養(yǎng)液的配制

在晨飼前用導(dǎo)管經(jīng)瘤胃瘺管真空抽取至少2只羊的瘤胃內(nèi)容物置于預(yù)熱至39℃的保溫瓶中，混合均勻后經(jīng)4層紗布過(guò)濾，量取所需體積（瘤胃液與人工瘤胃營(yíng)養(yǎng)液的體積比為1∶2）的瘤胃液迅速加入到準(zhǔn)備好的人工瘤胃營(yíng)養(yǎng)液中，制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液?；旌先斯ち鑫概囵B(yǎng)液邊加熱邊用磁力攪拌器攪拌，同時(shí)通入無(wú)氧CO2[7]。

1.3.4 加樣和培養(yǎng)

用自動(dòng)加液器向每個(gè)培養(yǎng)瓶中分別加入上述混合培養(yǎng)液60 mL。同時(shí)做3個(gè)空白（只有培養(yǎng)液而沒(méi)有底物）。將培養(yǎng)瓶迅速放入已預(yù)熱（39℃）的水浴箱中，待加液完畢后成批轉(zhuǎn)入人工瘤胃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，搖動(dòng)1次·h-1[8]。

1.3.5 樣品采集

在體外培養(yǎng)至24 h時(shí)，將培養(yǎng)瓶分別取出放入冰水浴中使其發(fā)酵停止，洗滌培養(yǎng)管瓶中的殘?jiān)⑵渑c對(duì)應(yīng)樣品離心所得沉淀一起用蒸餾水懸浮，再離心，重復(fù)兩次后在105℃烘干12～24 h，稱重并計(jì)算樣品干物質(zhì)消化率。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS（Statistical Analysis System）的ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan's方法進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。樣本干物質(zhì)消化率計(jì)算公式見(jiàn)式1。

瘤胃內(nèi)干物質(zhì)分解常數(shù)以Marquardt的方法為基礎(chǔ)，根據(jù)SAS的非線性回歸方式按下列公式測(cè)定出a、b、c的值[9]。瘤胃內(nèi)不同時(shí)間的干物質(zhì)降解率適合方程見(jiàn)式2。

式中，P為t時(shí)間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)小時(shí)率；a為快速降解部分（%）；b為慢速降解部分（%）；c為b的降解常數(shù)；t為待測(cè)飼料在瘤胃中滯留的時(shí)間（h）。

2 試驗(yàn)結(jié)果

瘤胃微生物適應(yīng)硝酸鹽前后添加不同劑量硝酸鹽對(duì)干物質(zhì)消化率的影響見(jiàn)表2。

表2 瘤胃微生物適應(yīng)硝酸鹽前后添加不同劑量硝酸鹽對(duì)干物質(zhì)消化率的影響%

由表2可知，瘤胃微生物未適應(yīng)硝酸鹽時(shí)，低NO3組與中NO3組、高NO3組干物質(zhì)消化率差異顯著（P＜0.05），中NO3組和高NO3組差異不顯著（P＞0.05）。瘤胃微生物已適應(yīng)硝酸鹽時(shí)，低NO3組與中NO3組、高NO3組干物質(zhì)消化率差異不顯著（P＞0.05），中NO3組和高NO3組差異不顯著（P＞0.05）。瘤胃微生物未適應(yīng)硝酸鹽時(shí)，對(duì)照組與低NO3組間差異顯著（P＜0.05），與中NO3組、高NO3組間差異不顯著（P＞0.05）。

瘤胃微生物已適應(yīng)硝酸鹽時(shí)，對(duì)照組與中、低NO3組的干物質(zhì)消化率均差異顯著（P＜0.05），與高NO3組差異極顯著（P＜0.01）。瘤胃微生物未適應(yīng)硝酸鹽時(shí)的低NO3組與已適應(yīng)硝酸鹽時(shí)的低NO3組、中NO3組差異不顯著（P＞0.05），與高NO3組間差異顯著（P＜0.05）。瘤胃微生物未適應(yīng)硝酸鹽的中NO3組與已適應(yīng)硝酸鹽的低NO3組、中NO3組差異顯著（P＜0.05），與高NO3組差異極顯著（P＜0.01）。瘤胃微生物已適應(yīng)硝酸鹽的高NO3組與低NO3組、中NO3組差異顯著（P＜0.05），瘤胃微生物適應(yīng)硝酸鹽前后的高NO3組間干物質(zhì)消化率差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，對(duì)照組的干物質(zhì)消化率顯著低于瘤胃微生物已適應(yīng)硝酸鹽時(shí)的低、中、高NO3組（P＜0.05）。瘤胃微生物已適應(yīng)硝酸鹽時(shí)，低、中、高NO3組間的干物質(zhì)消化率差異不顯著（P＞0.05）。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是瘤胃微生物已適應(yīng)硝酸鹽，亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化成氨的速度與硝酸鹽的還原成亞硝酸鹽的速度持平甚至超過(guò)，使瘤胃微生物可以利用更多的氮，并且適應(yīng)后瘤胃微生物利用硝酸鹽的能力大幅加強(qiáng)[10]。而微生物未適應(yīng)硝酸鹽時(shí)，低NO3組的干物質(zhì)消化率顯著高于對(duì)照組、中NO3組和高NO3組（P＜0.05）。出現(xiàn)這種狀況的原因是少量的硝酸鹽進(jìn)入瘤胃會(huì)經(jīng)瘤胃微生物的作用還原成亞硝酸鹽，并進(jìn)一步還原成氨，為瘤胃微生物提供氮源，促進(jìn)其對(duì)干物質(zhì)的消化[9]。

更大劑量的硝酸鹽進(jìn)入瘤胃時(shí)，硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的速度會(huì)逐漸加快，甚至超過(guò)亞硝酸鹽還原成氨的速度，在此過(guò)程中產(chǎn)生的亞硝酸鹽則表現(xiàn)出毒性作用，引起干物質(zhì)消化率降低[10]。試驗(yàn)結(jié)果證明，可通過(guò)逐漸添加硝酸鹽的方法使反芻動(dòng)物逐步適應(yīng)硝酸鹽，且不影響干物質(zhì)消化率。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，硝酸鹽在瘤胃微生物消化干物質(zhì)的過(guò)程中起著重要的作用，能夠促進(jìn)干物質(zhì)的消化吸收。

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